伊维菌素人工抗原的合成及其单克隆抗体的制备

摘要

伊维菌素(ivermectin，IVM)是来自放线菌属的阿佛曼链霉菌发酵产生的一种半合成的大环内酯类多组分的抗生素，是一种抗寄生虫药物。IVM在线虫及节肢动物方面具有高效、广谱杀虫等优点，已广泛应用于畜禽及水产养殖业上，并且在农业生产上也是一种广泛使用的杀虫剂，在医学临床上还可治疗人类的皮肤病。虽然伊维菌素的用剂量比较小，但是IVM在动物源性食品中的残留可能会对人及环境产生潜在的危害，并且在国际竞争中会影响我国农产品贸易的出口。我国农业部规规定了可食用哺乳动物肌肉组织中伊维菌素的最高残留限量为10μg/kg。因为剂量小，所以对于IVM残留的检测非常困难。
　　近些年来，人们密切关注IVM药物的残留对人类的危害性以及对环境存在的潜在的风险。目前用于IVM残留检测方法主要是高效液相色谱法，但其存在操作过程复杂、耗时、检测成本高、仪器昂贵等缺点，在实际应用中不能广泛的推广使用。因此，开发研究一种科学、快速、简单、高效的检测方法是很必要的，对于现场监控的痕量分析具有重要的意义。本试验是在人工完全抗原的制备和鉴定的基础上，拟制备高效价的多克隆抗体，进一步筛选特异性强的单克隆抗体，为建立动物源性食品中伊维菌素的残留免疫学快速检测方法奠定了基础。试验主要的研究结果有以下内容：
　　1、本试验依据伊维菌素的分子结构式，选择C4-OH、C5-OH进行结构改造，利用琥珀酸酐引入活性基团羧基，然后再利用 NHS法合成人工抗原IVM-BSA和IVM-OVA。用紫外分光度法和SDS-PAGE对偶联物进行定性判断，试验结果与预期结果相一致；用紫外分光光度法对偶联物IVM-BSA和IVM-OVA进行定量判断，其偶联比分别为14.1:1和14.7:1。
　　2、用偶联物IVM-BSA作为免疫原，免疫小鼠，免疫动物后产生抗 IVM的多克隆抗体，采用间接 ELISA法测定效价,并且利用间接竞争ELISA法测小鼠的敏感性，之后绘制标准曲线。结果显示：效价可达到1:12800，部分甚至达到1:25600，标准曲线方程为y=-0.2854x+0.7236，R2=0.9516，通过计算得出 IC50为6.07μg/mL，再次证明了成功制备了IVM的人工抗原，并且具有一定的免疫原性能够刺激机体产生免疫应答。
　　3、本次试验选用1号小鼠的脾脏进行细胞融合，细胞融合之后，采用间接ELISA和间接竞争ELISA法对杂交瘤细胞进行筛选，本次试验筛选出一株阳性杂交瘤细胞3F7，经三次亚克隆之后对其扩大培养，采用间接 ELISA法测定抗IVM单克隆抗体的效价，其中细胞上清的效价可以达到1:1280，腹水的效价可以达到1:105。利用间接竞争ELISA法检测抗IVM单克隆抗体的敏感性，绘制标准曲线，其中线性回归方程为y=-0.1384x+0.5911，R2为0.9921，计算得到的IC50为4.55μg/mL。

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1 文献综述

1.1 食品安全

1.2 伊维菌素的介绍

1.2.1 理化性质

1.2.2 伊维菌素的药理学

1.2.3 伊维菌素药理学研究

1.2.4 伊维菌素在动物源性食品中的最高残留限量

1.3 伊维菌素残留的检测方法

1.3.1 色谱学检测方法

1.3.2 免疫学检测方法

1.4 本研究的目的和主要内容

1.4.1 本试验的目的

1.4.2 本试验的主要内容

2 伊维菌素人工完全抗原的合成及鉴定

2.1 试验材料

2.1.1 试验仪器

2.1.2 试验试剂

2.1.3 试验常用溶液配制

2.1.4 试验用的动物

2.2 试验方法

2.2.1 伊维菌素半抗原的合成

2.2.2 伊维菌素人工完全抗原的合成

2.2.3 伊维菌素人工完全抗原合成产物的鉴定

2.2.4 结果及分析

2.3 结果与讨论

2.3.1 半抗原的设计

2.3.2 抗原的纯化以及鉴定

2.4 小结

3 抗伊维菌素单克隆抗体的制备

3.1 试验材料

3.1.1 试验仪器

3.1.2 试验试剂

3.1.3 试验常用溶液配制

3.2 试验方法

3.2.1 动物免疫

3.2.2 复苏小鼠的骨髓瘤细胞SP20

3.2.3 制备饲养细胞

3.2.4 制备脾细胞

3.2.5 细胞融合试验[83]

3.2.6 杂交瘤细胞的选择性培养

3.2.7 杂交瘤细胞的筛选与检测

3.2.8 阳性杂交瘤细胞的亚克隆

3.2.9 阳性杂交瘤细胞的冻存

3.2.10 腹水的制备

3.2.11 结果与分析

3.3 结果与讨论

3.3.1 免疫方式

3.3.2 动物细胞融合

3.4 小结

4 试验结论

参考文献

附录 英文缩写词汇表

致谢

个人简历、在学期间发表的学术论文与研究成果