枸橼酸咖啡因对新生大鼠缺氧缺血性脑损伤保护作用的研究

摘要

背景和目的：
　　新生儿缺氧缺血性脑损伤（Hypoxic-ischemic brain damage，HIBD）是指各种围生期高危因素引起脑组织不同程度缺氧、血流减少甚至中断，导致中枢神经系统损伤，是新生儿死亡及遗留脑性瘫痪、癫痫、智力障碍、行为缺陷等神经系统后遗症的重要原因，因此HIBD的早期干预成为众多学者研究的重点。枸橼酸咖啡因（caffeine citrate，CC）属于甲基黄嘌呤类药物，为非选择性腺苷受体（adenosine receptors，AR）拮抗剂，可透过血脑屏障，通过拮抗腺苷受体发挥生物学作用，临床上广泛用于治疗早产儿呼吸暂停（Apnea of premature， AOP）。研究表明，咖啡因不仅可以防治支气管肺发育不良（bronchopulmonary dysplasia，BPD），而且可以降低早产儿后期脑瘫及认知障碍的发生率。枸橼酸咖啡因系通过直接作用于脑组织起保护作用还是通过改善通气间接发挥神经系统保护作用的，具体机制目前尚不明确。本实验采用7日龄新生Sprague-Dawley（SD）大鼠，结扎左颈总动脉并缺氧制备HIBD动物模型，治疗组给予CC干预治疗，从海马神经细胞增生与凋亡、脑白质髓鞘碱性蛋白（myelin basic protein，MBP）表达及远期大鼠学习记忆能力的改变，探讨CC对新生大鼠脑组织的保护作用，并进一步通过检测CC对缺氧缺血后脑组织腺苷A1受体（Adenosine1 Receptors，A1R）mRNA和腺苷A2a受体（Adenosine
　　2a Receptors，A2aR）mRNA表达的影响，探讨CC对新生大鼠HIBD的保护作用及其可能机制。
　　材料与方法：
　　72只7日龄新生SD大鼠，随机分为假手术组、HIBD组、CC组，每组24只。假手术组仅分离左侧颈总动脉，不结扎不缺氧；HIBD动物模型制备参照Rice法，HIBD组和CC组均结扎左侧颈总动脉，然后放于母鼠身旁恢复1 h，进而置于37℃恒温的容器中，通入80 mL/L氧气和920 m L/L氮气的混合气体2 h。CC干预组在缺氧缺血（Hypoxic-ischemic，HI）前、HI后0min、24h、48h、72h腹腔注射20mg/kg的CC，假手术组和HIBD组等时间点腹腔注射等体积的生理盐水。至12日龄时每组处死16只大鼠，余饲养至28日龄：（1）在12日龄处死前各组随机选取8只新生大鼠，分别腹腔注射5-溴脱氧尿嘧啶核苷（5-bromodeoxyuridine，BrdU）标记新生细胞，剂量为50mg/kg，1次/12h，连续5次，最后一次腹腔注射BrdU4h后断头取脑，采用HE染色对各组大鼠脑组织HI侧CA1区光镜下行病理学观察，免疫组织化学法检测HI侧脑组织海马齿状回颗粒下层BrdU、海马CA1区活化半胱氨酸基天冬氨酸酶-3（Cleaved cysteine aspartic acid specific protease，活化 Caspase-3）、皮层下白质MBP的表达水平，TUENL法检测海马CA1区凋亡细胞；（2）至12日龄时，各组随机选取8只新生大鼠，采用Real Time PCR测定HI侧脑组织A1R mRNA、A2aR mRNA的水平；（3）余大鼠至28日龄时采用Y迷宫进行学习记忆能力的检测。
　　结果：
　　1.各组新生大鼠HI侧脑组织海马区病理学观察
　　假手术组大鼠HI脑海马CA1区结构完整、细胞层次清晰，形态正常；HI后脑组织出现不同程度的病理学改变，HIBD组表现为细胞排列紊乱、边界不清；CC干预组较HIBD组细胞层次相对清晰，排列整齐。
　　2.各组新生大鼠 HI侧脑组织海马齿状回BrdU、海马CA1区活化Caspase-3及TUNEL阳性细胞、皮层下白质MBP的表达情况
　　HIBD组、CC组、假手术组BrdU阳性细胞数分别为56.50±0.91、59.10±0.54、41.25±1.27，前两组均高于假手术组（ P<0.05），而前两组间无统计学差异（P>0.05）；各组活化 Caspase-3阳性细胞数表达高低依次为HIBD组、CC组、假手术组，分别为：52.38±1.60、25.88±0.64、14.00±0.27，三组间两两比较差异有统计学意义（P<0.05）；假手术组海马CA1区可见少量TUNEL阳性细胞（9.13±0.35），HIBD组阳性细胞数（37.38±0.94）最多，CC组（14.75±0.56）较HIBD组阳性细胞数明显减少，三组间两两相比有差异（P<0.05）；HIBD组较假手术组皮层下白质MBP（用IOD值表示）明显减少（P<0.05），给予CC干预后，MBP表达水平较HIBD组升高（P<0.05）。
　　3.各组大鼠HI侧脑组织A1R mRNA、A2aR mRNA的表达
　　HI后A1R mRNA较假手术组显著上调（1.28±0.34 vs1.02±0.18）（P<0.05），而A2aR mRNA变化不明显（1.13±0.36 vs1.09±0.21）（P>0.05），给予CC干预后A1R mRNA较HIBD组下降（0.94±0.17 vs1.28±0.34），差异有统计学意义（P<0.05），而A2aR mRNA下降不明显（0.96±0.14 vs1.13±0.36）（P>0.05）。
　　4.各组大鼠远期学习记忆能力的比较
　　28日龄时，Y迷宫测试显示大鼠学会逃避电击次数由低到高依次为假手术组（31.25±1.41）、CC组（39.75±2.51）、HIBD组（58.50±3.14），三组间两两比较差异有统计学意义（P<0.05）；记忆保持能力高低依次为 CC组（85.00±3.27）、假手术组（83.75±3.24）、HIBD组（56.25±3.24），前两组均高于HIBD组（P<0.05），前两组间无统计学差异（P>0.05）。
　　结论：
　　1.枸橼酸咖啡因能够减轻缺氧缺血后新生大鼠神经细胞凋亡和脑白质损伤，提示对大鼠脑有一定的保护作用。
　　2.枸橼酸咖啡因对新生大鼠HIBD的保护作用可能与下调腺苷A1R表达有关。
　　3.枸橼酸咖啡因可以改善大鼠HIBD后远期学习记忆能力。

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图表清单

1 引言

2 材料和方法

2.1 材料

2.2 实验方法

2.3 统计学方法

3 结果

3.1 各组新生大鼠HI侧脑组织病理改变

3.2 各组新生大鼠HI侧脑组织海马DG颗粒下层 BrdU、海马CA1区活化Caspase-3及TUNEL阳性细胞、皮层下白质MBP的表达情况

3.3 各组大鼠HI侧脑组织A1R mRNA、A2aR mRNA表达水平的变化

3.4 各组大鼠远期学习记忆能力的表达

4 讨论

4.1 新生大鼠HIBD动物模型

4.2 枸橼酸咖啡因对新生大鼠缺氧缺血性脑损伤的影响

4.3 枸橼酸咖啡因对缺氧缺血后腺苷A1、腺苷A2a表达水平的影响

4.4 枸橼酸咖啡因对学习记忆能力的影响

5 结论

6 附图

参考文献

综述 咖啡因在新生儿疾病中的应用进展

致谢

个人简历以及在研期间发表的论文