常染色体显性遗传多囊肾病伴发颅内动脉瘤患者PKD1基因突变的筛查

摘要

背景与目的:
　　颅内动脉瘤(intracrartial aneurysm，ICA)系颅内动脉血管壁形成的血管瘤样病变，一旦破裂便引起蛛网膜下腔出血。而且颅内动脉瘤破裂导致的死亡率和致残率非常高，所以ICA威胁着患者的生命健康，也给家庭和社会也带来了沉重的负担。颅内动脉瘤的发生存在着许多影响因素，其环境因素主要包括：高血压、抽烟、性别、酗酒、年龄、吸毒、季节等，前三项风险因素最为重要，也很可能是环境因素和遗传因素共同作用促进了疾病的发生，但是现在研究显示，遗传因素在ICA的发病中也占据重要的地位。
　　常染色体显性遗性多囊肾病(Autosomal dominant polycystic kidney disease,即：ADPKD)是临床上最常见的遗传性疾病之一，ADPKD是单基因遗传病，其患病率约为1/1000-1/400［1］，大约3/5的患者都存在家族性遗传史。而且此遗传病的外显率高，可达95％以上，80岁以上的携带者几乎均显示出该病的某些征象。ADPKD具有明显的遗传延迟性，其发病一般主要在中年以后，其病理特点主要表现在双侧肾脏上，可形成许多大小不等的液性囊肿，伴随着囊肿的不断增大，肾脏结构会遭到破坏，随之肾脏功能也随之丧失，最终发展为尿毒症，肾脏功能衰竭。通过临床观察发现：大约50%的患者，在60岁左右即会发展到终末期肾脏功能衰竭阶段［2］，所以目前肾脏功能衰竭是临床成人多囊肾病最常见的死亡原因之一。ADPKD是一种系统性的遗传性疾病，它的病变主要累及在双侧肾脏，除此之外还可波及到患者的肝脏、胰腺、脾脏、卵巢及全身心血管等多个系统，如发生在组织器官，可形成肝囊肿、脾囊肿、胰囊肿、卵巢囊肿和精囊囊肿等等；在全身心血管系统中，在冠状动脉、颅内动脉等动脉处均可形成大小不等的动脉瘤，如若动脉瘤发生在腹股沟处，患者可导致腹股沟疝，如发生在心脏瓣膜处，可导致心脏瓣膜异常，如瓣膜关闭不全等病变。PKD1、PKD2和PKD3基因是国内外已经报道的、引起ADPKD三种主要受累基因，而从目前研究发现，PKD1基因是引起ADPKD的最主要致病基因。
　　高分辨率熔解曲线（High Resolution Melting, HRM）技术是在国内外发展起的一种新型的遗传学检测方法。HRM技术源于熔解曲线，所以它是在实时荧光定量PCR的基础上，仅仅是增加改进了一种新型的荧光饱和染料，即：它是利用一种绿色的荧光饱和染料不断监控核酸双链变化情况，随后通过熔解曲线走形而进行分析。HRM技术不受突变碱基种类与位点的局限，具有速度快、操作简便、成本低，灵敏度和特异性高、准确率高和实现真正的闭管操作等优点，从而被迅速而广泛的应用到基因突变扫描，基因分型与序列匹配，甲基化分析，短片段重复序列与RNA编辑等多方领域中。
　　本研究中采用高分辨率熔解曲线（HRM）分析技术检测常染色体显性遗传多囊肾病（ADPKD）及其伴发颅内动脉瘤（ICA）患者的PKD1基因的突变，从而建立一种简便而又可靠的筛查、检测PKD1基因突变的方法，分析突变产生的位置和形式，从而进一步推断其发病机制，并探讨HRM技术特点，以及其用于临床ADPKD患者筛查与诊断的可行性。
　　方法:
　　收集整理2013年7月到2014年8月上海交通大学附属第六人民医院收治的ADPKD患者，所有患者均经B超、CT、磁共振血管成像法筛选患有颅内动脉瘤的患者，共收集ADPKD伴发ICA患者32例。采集32例患者术前清晨空腹外周血4mL，置于乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝管中,随后倒入医用干纱布上，晾干制成干血痕。常规酚-氯仿法抽提32例患者的基因组DNA。设计PCR反应和HRM分析所需的引物，对PCR反应条件进行优化，并扩增目的基因片段。随后用HRM法检测32例ADPKD患者PKD1基因的1到46号外显子的突变情况，并对HRM结果中，怀疑为突变的基因样本进行直接测序验证，从而确定样本存在的突变类型。
　　结果:
　　通过HRM技术对32例ADPKD伴发ICA患者的46个外显子的56个片段区域进行检测分析，有4对外显子引物未得到熔解曲线图，从获得的熔解曲线峰形图中可知，有9例（1、7、8、9、10、16、18、20和28号）患者存在28条异常的熔解曲线，9例患者标本经测序法得到证实，均存在PKD1基因的突变。本实验中共检出62个位点突变，其突变率为28.13%：62个突变均为点突变，其中错义突变28种，无义突变1种，同义突变12种。62个突变分布于13个外显子，其中11和15号外显子突变最多，均为12例，分别占总突变的19.36%；10号外显子9例突变，占14.52%；13号外显子8例突变，占12.90%；5和25号外显子均存在4例突变，分别占6.45%；29号外显子3例突变，占4.84%；7、16、23和26号外显子均存在2例突变，分别占3.23%；27和38号外显子均存在1例突变，分别占1.61%。直接测序法证实两种方法的检测结果完全一致。
　　结论:
　　用HRM法能快速、灵敏、准确的检测出ADPKD患者PKD1基因的突变情况，不仅可以检测出已知的基因突变，而且可以简便、快捷的筛查出一些未知的突变。经分析得出：新兴的HRM技术具有操作简便快速、实验结果准确、成本低、灵敏度高及其特异性高等优点，可作为ADPKD患者及ADPKD家族携带者的突变检测与筛查的优选方法，适合在临床推广。

目录

封面

声明

中文摘要

英文摘要

目录

中英文缩略词索引

1前言

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验样本

1.1.2 主要试剂

1.1.3 实验仪器

1.1.4主要试剂配制

1.1.5引物设计与合成

1.2 方法

1.2.1 样本采集

1.2.2 基因组DNA的提取

1.2.3基因组DNA纯度与浓度的检测

1.2.4长片段引物PCR扩增

1.2.5琼脂糖凝胶电泳鉴定LR PCR产物

1.2.6 HRM技术检测PKD1基因突变

1.2.7 测序验证

2. 结果

2.1血痕提取的DNA纯度及浓度检测结果

2.2 长片段PCR扩增结果

2.3 高分辨率熔解曲线检测结果

2.4 测序结果

3.讨论

4.结论

附表

附图

参考文献

综述:高分辨率熔解曲线技术及其应用进展

1.高分辨率溶解曲线技术的原理与特点

1.1 高分辨率溶解曲线技术基本原理

1.2 HRM技术的发展与特点

2.HRM在分子诊断中的应用进展

2.1 基因突变扫描(gene screening)

2.2 基因分型（genotyping）

2.3序列匹配（sequence matching）

2.4甲基化研究（methylation analysis)

2.5 SNP分析（ingle Nucleotide Polymorphism，SNP）

2.6 RNA编辑（RNA editing）

3．HRM技术的优势和不足

4. 展望

参考文献

个人简历、在研期间发表论文及奖励

致谢