Wnt/β-catenin信号通路参与吗啡耐受及其引起的痛觉过敏的作用

摘要

背景介绍：
　　Wnt信号通路广泛存在于多细胞真核生物中，并且在进化上高度保守。在胚胎发育和成体组织稳态维持中，Wnt信号转导级联效应控制着大量的生物学反应。自发现以来的30多年，已发现Wnt信号通路参与的生理过程有：调控脑发育、调控细胞增殖、分化、极性形成、迁移、凋亡等。最近研究表明，Wnt信号功能失调还与多种疾病的发病机制有密切的关系，例如信号相关分子 APC、β-catenin、Axin等基因突变促进结直肠癌、黑色素瘤、腺瘤性息肉病等恶性肿瘤的发生和转移，Wnt信号通路调节异常引起脑局部缺血、帕金森综合症、阿尔茨海默症等多种神经系统疾病和Ⅱ型糖尿病等代谢性疾病。目前已知的Wnt信号通路主要有Wnt/β-catenin通路；Ca2+通路；以及PCP通路。其中Wnt/β-catenin信号通路研究最广泛。
　　吗啡是1806年德国化学家F.W.A.首次从鸦片中分离出来的生物碱，其衍生物盐酸吗啡等至今仍是临床上常用的镇痛剂，用于严重创伤、手术、烧伤，以及晚期癌症等引起的中、重度疼痛。然而，长期持续使用吗啡易造成吗啡镇痛作用下降，即吗啡耐受；停用吗啡后还有可能出现痛觉过敏（轻微非伤害性的触碰即引起剧烈疼痛）的现象。这些副作用大大影响了吗啡的临床应用，目前仍无有效的控制手段。因此，理解吗啡耐受和痛觉过敏的分子机制是解决这一问题的关键。
　　吗啡耐受和痛觉过敏的发生机制目前尚不明确。有文献报道吗啡耐受与神经病理性疼痛有相同的分子和细胞基础，包括兴奋性氨基酸受体激活引起的神经中枢异常兴奋，以及随后细胞内发生的蛋白酶 C激活和移位、一氧化氮的产生等。最新文献报道Wnt/β-catenin信号通路参与神经病理性疼痛的产生和维持，但是否在吗啡耐受和痛觉过敏中发挥作用还需要进一步研究证实。
　　目的：
　　本实验观察吗啡耐受及停用吗啡引起的痛觉过敏中，大鼠脊髓背角及背根神经节中Wnt/β-catenin信号相关分子的表达变化，以及阻断Wnt/β-catenin信号通路对大鼠吗啡耐受及痛觉过敏的干扰作用，以确定 Wnt/β-catenin信号通路在吗啡耐受和痛觉过敏中的作用。
　　方法：
　　1、采用大鼠鞘内反复注射小剂量吗啡的方法，诱导吗啡耐受和痛觉过敏动物模型。体重250 g的SD大鼠在异氟烷吸入麻醉状态下，施以鞘内置管术，将PE10管一端开口于脊髓腰膨大，另一端从颈后皮肤穿出。手术恢复期开始动物适应性训练，持续3-5天；随后连续6天鞘内反复注射小剂量吗啡，剂量为10μg/10μl，每天2次；对照组注射10μl的生理盐水。
　　2、鞘内注射信号阻断剂 IWR，观察阻断Wnt/β-catenin信号通路对吗啡耐受和痛觉过敏的干扰及逆转作用。干扰实验分组：将鞘内置管成功的24只SD大鼠随机分成4组，每组6只：①生理盐水+DMSO溶剂组；②吗啡+DMSO溶剂组；③吗啡+高剂量IWR；④吗啡+低剂量IWR。逆转实验分组同干扰实验分组的第②、④组。注射方式为吗啡或生理盐水：每天2次，每次10μg/10μl；高剂量IWR指50μM/10μl，低剂量IWR指25μM/10μl，在每天吗啡注射前30min注射，或者在吗啡耐受建立后开始注射，每天1次，持续5天（第7天至第11天）。
　　3、痛行为学测试。在开始吗啡注射的第0、1、3、5、7、9、11天，进行甩尾潜伏期（TFL）测试，以观察TFL基础值（0天）、吗啡耐受的建立（1、3、5、7天），信号阻断剂IWR对吗啡耐受的阻断（1、3、5、7天）或逆转（1、3、5、7、9、11天）。并采用公式：[(检测值-基础值)/（10-基础值）]x100％计算吗啡最大镇痛效率（%MPAE）（其中10代表cut-off值）。在开始吗啡注射的第0天以及停用吗啡后第1天分别进行机械刺激撤足阈值（PWMT）和热刺激撤足潜伏期(PWHL)的测试，以观察痛觉过敏的建立，及IWR对痛觉过敏的阻断或逆转作用。
　　4、取吗啡注射0、1、3、5、7及停用后3天的吗啡耐受模型大鼠的脊髓和背根神经节（DRG）组织，采用Western blot检测脊髓背角和DRG中Wnt3a的表达及变化。
　　5、取吗啡耐受组及对照组大鼠的脊髓和DRG组织，采用免疫组化检测Wnt3a的表达，并使用Wnt3a与IB4、GFAP、NF-200、NeuN、OX-42等蛋白标志的免疫荧光共染色，鉴别Wnt3a阳性细胞的类型。
　　6、取吗啡耐受组、对照组及药物阻断组大鼠的脊髓和DRG组织，采用qPCR进一步观察Wnt/β-catenin信号通路相关分子的表达变化。实验分组为①生理盐水+DMSO溶剂组；②吗啡组+ DMSO溶剂组；③高剂量IWR50μM+吗啡组。使用总RNA提取试剂盒提取脊髓和DRG（L4、L5）RNA；Nanodrop仪器检测RNA浓度及纯度后，取等量的总RNA在随机引物作用下反转录成cDNA。使用Thermo Scientific SYBR Green qPCR试剂进行qPCR反应，检测Wnt/β-catenin信号分子包括通路的配体Wnt3a、Wnt5a基因和受体Fzd1、Fzd8基因，通路靶基因Axin2、β-catenin、c-Myc。
　　7、统计学处理。上述实验均至少重复3次取平均值，采用SPSS21.0统计软件，单因素方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。
　　结果：
　　1.本实验建立稳定的吗啡耐受和痛觉过敏模型，鞘内注射吗啡的第3天之后，吗啡的镇痛作用开始下降，TFL显著缩短；第7天，吗啡镇痛作用完全消失，TFL值降低至基础值；第8天（即停用吗啡后1天）出现PWMT和PWHL显著减小。
　　2.持续小剂量吗啡的鞘内注射诱导脊髓和DRG中Wnt3a蛋白量迅速增加，并且在停用吗啡后仍维持较高的表达水平。
　　3.吗啡耐受大鼠的脊髓背角和DRG中Wnt3a+细胞数量显著增加，并且脊髓中Wnt3a+细胞主要是GFAP+的星形胶质细胞和OX42+的小胶质细胞；DRG中Wnt3a+细胞主要是痛觉传导相关的IB4+的小细胞和NF-200+的中等细胞，在GFAP+的卫星样胶质细胞中仅少量表达。
　　4.在吗啡耐受形成之前预注射Wnt/β-catenin信号通路的抑制剂IWR25μM/10μl或50μM/10μl，痛行为学测试提示，吗啡耐受显著延迟，并减轻，吗啡停用后的痛觉过敏显著缓解。然而在吗啡耐受形成之后相同剂量的IWR阻断Wnt/β-catenin信号通路，对吗啡耐受有一定的缓解作用，但对已形成的痛觉过敏缓解作用不明显。
　　5.实时定量PCR结果显示，在吗啡耐受大鼠模型中，脊髓Wnt/β-catenin信号通路激活，靶基因Axin2、c-Myc、β-catenin表达上调。脊髓和DRG组织中的Wnt/β-catenin信号通路的受体Fzd1和Fzd8基因，以及DRG组织中配体Wnt3a和Wnt5a基因的表达均发生显著上调。采用IWR阻断Wnt/β-catenin信号通路之后，脊髓中Wntt/β-catenin信号通路靶基因c-Myc和β-catenin的表达显著下调。
　　结论：
　　Wnt/β-catenin信号通路参与吗啡耐受及停用吗啡后引起的痛觉过敏。

目录

封面

声明

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英文摘要

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英文缩略词表

前言

材料与方法

1 实验材料

2 实验方法

实验结果

1 建立稳定的吗啡耐受大鼠模型

2 吗啡耐受大鼠的脊髓和DRG中Wnt/β-catenin信号通路配体Wnt3a蛋白水平的检测

3 Wnt/β-catenin信号通路配体Wnt3a的表达与分布

4 阻断Wnt/β-catenin信号通路对吗啡耐受的干扰作用

5 阻断Wnt/β-catenin信号通路对停用吗啡引起的痛觉过敏的影响

6 阻断Wnt/β-catenin信号通路对吗啡耐受的逆转作用

7 阻断Wnt/β-catenin信号通路对吗啡引起的痛觉过敏的逆转作用

8 Wnt/β-catenin信号通路阻断剂IWR对通路的阻断作用

9 吗啡诱导Wnt/β-catenin信号通路其他的相关基因的表达变化

讨论

结论

参考文献

综述:Wnt信号通路及其在疾病靶点治疗中的作用研究进展

个人简历

基本情况

教育经历

学术论文研究成果

研究成果

致谢