DD-Ⅰ患者发现初期与五年后临床表型对比和乳牙超微结构观察及致病基因的确定

摘要

研究背景:遗传性牙本质发育缺陷性疾病是一类牙本质发育异常的常染色体显性遗传疾病，主要分为两种类型：牙本质发育不全（dentinogenesis imperfecta,DGI）和牙本质发育不良(dentin dysplasia,DD),其中DGI又分为DGI-Ⅰ、DGI-Ⅱ、DGI-Ⅲ三种类型，DD又分为DD-Ⅰ、DD-Ⅱ两种类型。
　　遗传性Ⅰ型牙本质发育不良（DD-Ⅰ）是一类严重影响牙齿根部发育导致青少年时期牙齿自发脱落的常染色体显性遗传病，其发病率1/100000，乳牙和恒牙均受累。1920年由Ballsehmiede最先报道，其显著特征为患者牙根畸形，锥形或钝形，明显缩短，根柱或变长；临床表现为乳恒牙的提早脱落。Shields描述了DD-Ⅰ的临床诊断要素：1）牙冠颜色形态基本正常，全口乳、恒牙均可受累；2）冠部牙本质正常，根部牙本质发育缺陷；3）X线片显示冠部髓腔多闭塞或呈“细线形”，根部髓腔完全闭塞，牙根短小或无牙根，部分患牙牙根尖有不明原因低密度透射影。这一诊断要素成为后来研究者的临床诊断标准。目前，关于DD-Ⅰ的研究主要是其临床家系表型的研究，关于DD-Ⅰ的超微结构的研究不是很多，而且到目前为止，DD-Ⅰ的致病基因仍然没有确定。
　　目的:
　　1.对比该DD-Ⅰ家系中先证者及其堂弟发现初期和五年后的临床表型。
　　2.观察分析DD-Ⅰ患者乳牙的超微结构。
　　3.确定该DD-Ⅰ家系的致病基因。
　　实验方法:
　　1.临床上，本课题组遇到一个DD-Ⅰ家系，该家系可追溯四代，共31人，现存三代，包括11个患者。对比先证者（IV5）和先证者的堂弟（IV6）发现初期和五年后的临床表型的变化。分别收集了DD-Ⅰ患者（IV6）的两颗乳牙和相同性别及年龄相似的两颗同名健康乳牙作为对照。采用光学电子显微镜、扫描电子显微镜、透射电子显微镜观察了DD-Ⅰ患者乳牙和正常乳牙的超微结构。
　　2.利用酚/氯仿法提取外周血DNA，共采集了该家系DNA样品23个，其中正常人13，患者10。然后将这23个DAN样品用Affymetrix Genome-wide Human SNP Arrays6.0进行了全基因组扫描分析，并用Merlin v.1.0对LOD值进行多个位点的连锁分析。
　　3.根据上述结果，针对候选区域，选取了多个 STR位点，外显率分别设定为80％，90%，99%，和100%，确定致病基因所在染色体。从而进行进一步的分析，结合目标区域捕获测序法筛查SNP及家系共分离和Sanger测序确定致病基因。
　　实验结果:
　　2.就DD-Ⅰ乳牙的超微结构而言，主要有以下发现：（1）相比正常乳牙来说，DD-Ⅰ患者乳牙的牙本质更薄；（2）正常的釉质牙本质界是平坦的或者呈贝壳状，而DD-Ⅰ患者乳牙的釉质牙本质界贝壳的弧度更平；（3）在DD-Ⅰ患者的牙齿中，釉质牙本质界面有微孔；（4）DD-Ⅰ患者乳牙中存在特征性的“溪流绕圆石”的结构；（5）DD-Ⅰ患者乳牙的胶原纤维是无规则的。
　　3.通过Affymetrix Genome-wide Human SNP Arrays6.0进行了全基因组扫描分析，并用Merlin v.1.0对LOD值进行多个位点的连锁分析。经过计算并绘制图形得出，3号染色体和18号染色体的LOD值大于3。选取STR位点分析并结合家系信息，进行候选区域的连锁分析检测，对该家系进行2个候选区域LOD值计算。根据目前计算各候选区域的LOD结果，18号染色体候选区域的部分区段LOD大于3，有非常高的几率与疾病连锁；而3号染色体候选区域全是LOD小于0，基本可以排除与疾病连锁。经课题组成员对18号染色体进行进一步的分析，结合目标区域捕获测序法筛查SNP及家系共分离和确定致病基因VPS4B，通过Sanger测序发现VPS4B基因第7号内含子第46位C>G的突变。
　　实验结论:
　　DD-Ⅰ患者的乳牙和恒牙均受累，临床及超微结构的观察研究有助于进一步理解DD-Ⅰ的发病机制。通过实验分析，将家系的致病基因定位于18号染色体VPS4B基因第7号内含子第46位C>G的突变，可以以此为基础，从分子水平研究DD-Ⅰ的发病机制。

目录

封面

声明

中文摘要

英文摘要

中英文缩略词

目录

引言

第一部分 I型牙本质发育不良的家系收集及乳牙超微结构的研究

1 材料和方法

1.1 试剂

1.2 仪器设备

1.3 家系来源

1.4 牙齿磨片的制作及观察

1.5 扫描电镜样品制备及观察

1.6 透射电子显微镜样品的制备与观察

2 实验结果

2.1 家系收集及临床表现

2.2 光学显微镜下所示

2.3 扫描电子显微镜下所示

2.4 透射电子显微镜下所示

3 实验讨论

第二部分 I型牙本质发育不良家系致病基因的确定

1 材料和方法

1.1 全外周血DNA提取试剂

1.2 主要仪器和设备

1.3 实验步骤

2 实验结果

3 讨 论

实验结论

实验的局限性

未来的研究计划

1.DD-I型牙本质发育不良患牙超微结构分析

2.DD-I型家系寻找与VPS4B基因验证

3.致病基因在细胞及组织水平的表达检测

4.致病基因在组织水平的时空表达检测

5.DNA及蛋白质相互作用研究

6.致病基因敲除小鼠模型建立

参考文献

综述: 牙齿发育相关的信号分子通路

个人简历、在学期间发表的学术论文与研究成果

致谢