表达非分泌白介素12的新型溶肿瘤腺病毒对叙利亚仓鼠胰腺癌的治疗作用

摘要

本研究构建了三个基因删除(TD)并表达非分泌IL-12(nsIL-12)的新型溶肿瘤腺病毒Ad-TD-nsIL-12。在具有完整免疫系统的叙利亚仓鼠体内进行了Ad-TD-nsIL-12的抗肿瘤效果和安全性研究。
　　第一部分 新型溶肿瘤腺病毒的构建与鉴定
　　1 目的:构建并鉴定具有肿瘤靶向性和表达免疫治疗基因的新型溶肿瘤腺病毒。
　　2 方法:2.1 高保真酶克隆目的基因，插入含有左右同源臂的穿梭质粒载体中，构建重组穿梭载体。2.2 将构建好的重组穿梭质粒线性化，通过电击转化与腺病毒载体在BJ5183细菌中进行同源重组。2.3 将构建成功的腺病毒载体线性化，转染293细胞，生成有感染能力的病毒。批量生产并纯化病毒。纯化后的病毒进行全基因组测序，ELISA检测细胞感染病毒后IL-12的表达水平。2.4 分离人、叙利亚仓鼠和小鼠的外周血单个核细胞(PBMC)，在PHA刺激后，加入IL-12标准品和新型溶肿瘤病毒表达的IL-12，检测单个核细胞增殖情况。分离叙利亚仓鼠的脾细胞，在PHA刺激后，加入人IL-12，检测叙利亚仓鼠脾细胞表达IFN-γ和TNF-α的表达。
　　3 结果:3.1 测序分析证实成功构建了pssIL-12、pssnsIL-12和pssLUC重组穿梭载体。3.2 酶切鉴定和测序分析证实，成功构建了新型溶肿瘤腺病毒载体Ad-TD-IL-12、Ad-TD-nsIL-12和Ad-TD-LUC.3.3 成功生产出高滴度的腺病毒，基因组测序表明病毒基因序列完全正确，ELISA结果显示Ad-TD-IL-12和Ad-TD-nsIL-12均表达IL-12。3.4 Ad-TD-IL-12和Ad-TD-nsIL-12表达的人IL-12刺激人和叙利亚仓鼠的PBMC的增殖，而不能刺激小鼠的PBMC的增殖。人IL-12能刺激叙利亚仓鼠脾细胞表达IFN-γ，和TNF-α。
　　4 结论:成功构建和生产了表达治疗基因的新型靶向溶肿瘤腺病毒，并发现人IL-12对叙利亚仓鼠免疫细胞有功能。
　　第二部分 新型溶肿瘤腺病毒对叙利亚仓鼠胰腺癌的治疗作用
　　1 目的:检测新型溶肿瘤腺病毒对胰腺癌的治疗作用。
　　2 方法:2.1 细胞杀伤实验（MTS法）检测dl1520和新型溶肿瘤腺病毒对叙利亚仓鼠胰腺癌和肾癌细胞系的杀伤作用。2.2 通过复制实验检测dl1520和新型溶肿瘤腺病毒在正常细胞和肿瘤细胞中的复制能力。2.3 构建叙利亚仓鼠胰腺癌HPD1NR皮下肿瘤模型，当肿瘤体积为80mm3和160mm3时，检测dl520和Ad-TD-LUC的治疗作用;当肿瘤体积达到310mm3时，检测Ad-TD-LUC，Ad-TD-IL-12和Ad-TD-nsIL-12的治疗作用。2.4 构建叙利亚仓鼠胰腺癌Hap-T1原位肿瘤模型，检测不同剂量下Ad-TD-LUC，Ad-TD-IL-12和Ad-TD-nsIL-12的治疗作用。2.5 构建叙利亚仓鼠胰腺癌腹腔播散肿瘤模型，检测不同剂量下Ad-TD-LUC，Ad-TD-IL-12和Ad-TD-nsIL-12的治疗作用。
　　3 结果:3.1 细胞杀伤实验发现新型溶肿瘤腺病毒对叙利亚仓鼠胰腺癌和肾癌细胞系的杀伤作用比dl1520更强。3.2 病毒复制实验表明新型溶肿瘤腺病毒比dl1520在正常细胞中复制能力弱，在肿瘤细胞中比dl1520强。3.3 在叙利亚仓鼠仓鼠胰腺癌HPD1NR皮下肿瘤模型中，当肿瘤体积为80mm3和160mm3时，dl520和Ad-TD-LUC都对肿瘤具有较好的治疗作用;当肿瘤体积为160mm3时，dl520无明显疗效，但Ad-TD-LUC能显著抑制肿瘤生长;当肿瘤体积达到310mm3时，Ad-TD-IL-12和Ad-TD-nsIL-12能完全治愈肿瘤，而Ad-TD-LUC无明显肿瘤抑制作用。3.4 在低剂量下，Ad-TD-nsIL-12能显著提高荷胰腺癌Hap-T1原位肿瘤的叙利亚仓鼠生存率，Ad-TD-LUC无明显治疗效果，而Ad-TD-IL-12导致全部实验动物比对照组死亡更早。在提高Ad-TD-LUC和Ad-TD-nsIL-12的剂量和降低Ad-TD-IL-12的剂量后，Ad-TD-nsIL-12能显著提高叙利亚仓鼠生存率，Ad-TD-LUC和Ad-TD-IL-12无明显治疗效果，低剂量Ad-TD-IL-12仍导致部分实验动物比对照组死亡更早。3.5 在叙利亚仓鼠仓鼠胰腺癌SHPC6腹腔播散肿瘤模型中，Ad-TD-LUC能显著提高荷叙利亚仓鼠生存率，Ad-TD-nsIL-12能治愈所有荷瘤动物，而高中低三个剂量的Ad-TD-IL-12都不能显著提高荷叙利亚仓鼠生存率。在给予一次大剂量的Ad-TD-nsIL-12也能治愈所有荷瘤动物。
　　4 结论:Ad-TD-nsIL-12在不同的胰腺癌肿瘤模型中具有很强的抗肿瘤作用和安全性。
　　第三部分 新型溶肿瘤腺病毒的安全性和抗肿瘤机制研究
　　1 目的:检测Ad-TD-nsIL-12的安全性和抗肿瘤作用机制。
　　2 方法:2.1 采用生化分析仪检测叙利亚仓鼠胰腺癌腹腔播散模型在腹腔注射溶肿瘤腺病毒后在第1，3，5天外周血中反映肝功能的酶水平和IL-12的表达情况。HE染色检测叙利亚仓鼠胰腺癌原位模型在腹腔注射溶肿瘤腺病毒后在第1和3天肝脏细胞损伤情况。2.2 将胰腺癌皮下肿瘤模型疗效实验中Ad-TD-IL-12或者Ad-TD-nsIL-12治疗组肿瘤全部被清除的实验动物重新接种原皮下接种的胰腺癌肿瘤细胞HPD1NR和肾癌细胞Hak，其中一组在接种HPD1NR的前一天腹腔注射CD3删除抗体。在叙利亚仓鼠胰腺癌SHPC6腹腔播散模型治疗40天后，在腹腔重新接种SHPC6。2.3 构建叙利亚仓鼠仓鼠胰腺癌HPD1NR皮下肿瘤模型，当肿瘤体积为300mm3时，腹腔内注射对照抗体，CD3和CD4删除抗体，第二天开始肿瘤内注射Ad-TD-nsIL-12进行治疗，观察肿瘤生长情况。2.4 构建叙利亚仓鼠仓鼠胰腺癌HPD1NR皮下肿瘤模型，当肿瘤体积为300mm3时，肿瘤内注射一次新型溶肿瘤腺病毒进行治疗，在第3，7，21天分别取动物的脾脏、引流淋巴结和肿瘤组织，分别进行流式细胞术、实时荧光定量PCR和免疫组化检测脾脏、引流淋巴结和肿瘤组织的免疫细胞群和细胞因子的变化。2.5 构建叙利亚仓鼠仓鼠胰腺癌Hap-T1原位肿瘤模型，腹腔内注射新型溶肿瘤腺病毒进行治疗，在不同时间点分别取动物的肝脏、外周血和肿瘤组织，分别进行ELISA、实时荧光定量PCR和免疫组化检测IL-12表达、免疫细胞群和病毒蛋白的变化。2.6 将nsIL-12基因插入到溶肿瘤痘苗病毒和腺病毒11载体中，构建了VV-nsIL-12和Ad11-nsIL-12。构建叙利亚仓鼠胰腺癌SHPC6腹腔播散肿瘤模型，检测不同剂量下VV-nsIL-12和Ad11-nsIL-12的治疗作用。
　　3 结果:3.1 生化分析显示Ad-TD-nsIL-12和对照病毒Ad-TD-LUC不引起明显的肝功能的酶AST、ALT和ALP水平的升高，而Ad-TD-IL-12引起肝功能的酶水平显著增高;在外周血中Ad-TD-IL-12高表达IL-12，而Ad-TD-nsIL-12持续表达低水平的IL-12。3.2 当胰腺癌皮下肿瘤模型疗效实验中的肿瘤全部被清除的实验动物重新接种原皮下接种的肿瘤细胞HPD1NR时，不能形成肿瘤;接种的肾癌细胞Hak肿瘤持续生长;在接种HPD1NR的前一天腹腔注射CD3删除抗体的动物的肿瘤持续生长。荷胰腺癌腹腔播散模型的叙利亚仓鼠经治疗40天后重新接种SHPC6，90％实验动物未复发。3.3 叙利亚仓鼠仓鼠胰腺癌HPD1NR皮下肿瘤模型，在Ad-TD-nsIL-12治疗的前一天腹腔内注射对照抗体，CD3和CD4删除抗体。CD4删除抗体和对照抗体不影响Ad-TD-nsIL-12的抗肿瘤效果，而CD3删除抗体能抑制Ad-TD-nsIL-12抗肿瘤作用。3.4 在肿瘤组织中，Ad-TD-nsIL-12和Ad-TD-IL-12对肿瘤浸润T淋巴细胞有相同的影响。在脾脏、引流淋巴结和肿瘤组织中，Ad-TD-nsIL-12和Ad-TD-IL-12引起促进抗肿瘤作用的相关细胞因子表达增高。Ad-TD-nsIL-12仅能在第7天使引流淋巴结的CD4+和CD3+CD4-T细胞增加，不影响脾脏内T细胞的增殖，而Ad-TD-IL-12除了能在第7天使引流淋巴结的CD3+CD4-T细胞增加外，在3，7，21天还影响脾脏内CD3+CD4-T细胞的增殖。3.5 肿瘤生长曲线显示，Ad-TD-nsIL-12能显著抑制肿瘤生长。实时荧光定量PCR结果显示溶肿瘤病毒主要靶向肿瘤细胞。免疫组化显示病毒在肿瘤组织内复制，并且导致肿瘤浸润淋巴细胞增加。HE染色显示Ad-TD-nsIL-12对肝脏无明显毒性。3.6 叙利亚仓鼠胰腺癌SHPC6腹腔播散肿瘤模型，在经过VV-nsIL-12、Ad11-nsIL-12和相应对照病毒的治疗后。VV-nsIL-12和Ad11-nsIL-12均能显著提高叙利亚仓鼠的生存率。
　　4 结论:4.1 Ad-TD-nsIL-12的安全性是因为能持续、局部和低表达IL-12;仅影响局部免疫器官，改变肿瘤微环境;4.2 Ad-TD-nsIL-12治疗能引起特异的肿瘤免疫反应和长期的免疫保护，起主要作用的是CD3+CD4-(CDS+)T细胞。

目录

声明

摘要

缩略词表

前言

第一部分 新型溶肿瘤腺病毒的构建及鉴定

前言

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

4 结论

参考文献

第二部分 新型溶肿瘤腺病毒对叙利亚仓鼠胰腺癌的治疗作用

前言

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

4 结论

参考文献

第三部分 新型溶肿瘤腺病毒的安全性和抗肿瘤机制研究

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

4 结论

参考文献

全文结论

综述 溶肿瘤病毒与肿瘤治疗

个人简历

发表文章和主持参与的课题

致谢