CTX-M型超广谱β-内酰胺酶在肺炎克雷伯菌中的分子进化机制研究

摘要

背景与目的：
　　肺炎克雷伯菌为临床感染中常见的革兰阴性杆菌之一。由于该菌易引起临床条件致病以及菌株多具有多重耐药性，其已成为临床抗感染治疗中的主要难点之一。肺炎克雷伯菌的临床分离率以在ICU和呼吸内科为高，主要感染施行气管插管或配备呼吸机的免疫力低下的患者。随着广谱β-内酰胺类药物以及碳青霉烯类药物的使用，多重耐药的肺炎克雷伯菌，尤其是携带超广谱β-内酰胺酶或碳青霉烯酶的菌株，在临床中的检出率也是逐年升高。而且在抗菌药物的选择压力下，新型别耐药基因的产生、传播和流行，使得耐药菌感染患者不能得到抗菌药物及时有效的治疗，延误了病人病情，增加了医疗成本。因此，对新型别耐药基因的研究、检测，遏制耐药基因进一步的进化与传播，成为耐药细菌研究领域的热点。
　　CTX-M型ESBLs近年来已经超过TEM型及SHV型，成为革兰阴性杆菌中流行最为广泛的超广谱β-内酰胺酶，携带CTX-M型ESBLs也是肺炎克雷伯菌产生耐药的主要分子机制之一。CTX-M型 ESBLs对头孢类抗菌药物具有较高的水解活性，并且其由质粒携带传播的特点，也利于CTX-M型ESBLs新型别的产生、传播与流行。并且此类菌株往往涉及其他多种耐药机制，产生的多重耐药菌在临床抗菌药物的选择压力下，较一般菌株能够更快地进化、适应与流行。鉴于耐药基因的快速演化及耐药菌株的广泛流行，明确CTX-M型ESBLs的进化路径，预测未来可能出现的耐药基因新型别，成为了当前研究的重要内容之一。
　　基于基因测序技术与生物信息学的快速发展，依靠基因序列生物计算学分析的细菌进化研究也有了长足的进步。收集海量的临床耐药菌株，经由基因测序技术，可建立起一系列耐药基因的存储数据库。而生物信息学软件的开发为大规模基因序列的分析提供了高效精准的工具。利用基因序列的生物信息学分析，已经构建了诸如SHV型和TEM型ESBLs的全球范围内的进化图谱，并且通过基因序列构建系统进化树的方法，发现了CTX-M型ESBLs的起源与分化。然而单纯依靠基因序列相似性而确立的进化关系，并不能真实可靠的反映临床抗菌药物选择压力下，耐药基因间准确的进化关系。只有建立在临床资料上的进化分析，才能建立临床用药情况下耐药基因的进化路径。
　　另一方面，基于实验室模拟方法下进化路径的构建，同样是目前研究的热点。其中西班牙进化生物学家Angela Novais凭借实验室中抗菌药物Darwin选择的方法，构建出了CTX-M-1型ESBLs的进化图谱。然而基于实验室模拟的方法，并不能完全还原临床用药下微环境的改变，因此其结果并不能指导临床的用药方案。
　　为解决上述问题，我们设计了本课题，旨在通过临床资料与生物信息学分析相结合的方式，并参考之前实验室模拟的结果，对河南地区CTX-M型ESBLs进行进化路径的分析，明确本地区CTX-M型ESBLs携带株的耐药表型与其耐药基因型别，构建河南地区CTX-M型ESBLs的进化路径，预测未来可能产生的新型耐药基因型别，为临床抗感染治疗提供可靠的参考依据。
　　方法：
　　（1）菌株收集收集2014年8月至11月间，郑州大学第一附属医院检验科微生物室所分离的耐头孢类抗菌药物的肺炎克雷伯菌共72株，所有菌株均采用VitekⅡCompact鉴定至种。
　　（2）菌株药敏分析及ESBLs表型确证试验参照CLSI2014年标准对药敏实验与表型确证试验结果进行分析。
　　（3）常见耐药基因扩增与基因型别鉴定采用普通 PCR方法对常见的ESBLs编码基因以及碳青霉烯酶编码基因进行扩增，并且进行测序得到基因型别。
　　（4）耐药菌株同源性分析利用RAPD-PCR方法对CTX-M型ESBLs携带菌株以及碳青霉烯酶携带菌株进行菌株同源性分析。
　　（5）CTX-M型ESBLs进化路径分析采用局部序列比对、构建系统进化树、正选择位点分析以及蛋白质三维构象分析等生物信息学方法分析 CTX-M型ESBLs的进化路径。
　　结果：
　　1.肺炎克雷伯菌ESBLs检出情况
　　检出CTX-M型ESBLs阳性菌株60株，其中包括CTX-M-3、CTX-M-15、CTX-M-55、CTX-M-9、CTX-M-14、CTX-M-27以及 CTX-M-65共7种不同CTX-M型别。而携带 CTX-M型 ESBLs的菌株同时也携带 SHV、TEM以及OXA-10三种其他型别的ESBLs，并且有21株CTX-M型ESBLs携带菌株同时携带有KPC-2型或NDM-1型碳青霉烯酶。
　　2.CTX-M型ESBLs的进化路径
　　本地区检出CTX-M-3→CTX-M-15→CTX-M-55进化路径，并且第80位及第242位氨基酸为正选择位点，突变位点所在的蛋白质结构域影响 CTX-M-3组ESBLs的水解活性。而所检出的CTX-M-14组ESBLs并未检出明确的进化路径。
　　3.同时携带CTX-M-65型ESBLs与KPC-2型碳青霉烯酶的耐药菌株
　　本次研究首次在河南地区发现CTX-M-65型ESBLs，CTX-M-65型ESBLs与CTX-M-14型ESBLs相比，在第80位与第275位氨基酸发生突变。并且此次发现的CTX-M-65型ESBLs携带株均同时携带有KPC-2型碳青霉烯酶。
　　结论：
　　1. CTX-M型ESBLs携带菌株，同时携带其他类型ESBLs乃至碳青霉烯酶。建议临床抗肺炎克雷伯菌感染治疗时，应当合理应用β-内酰胺类药物，注意与其他抗菌药物联合使用。
　　2.本地区存在 CTX-M-3→CTX-M-15→CTX-M-55进化路径，预示沿此路径将出现新型别的CTX-M型ESBLs。提示临床应加强CTX-M基因的监测与防控工作，避免耐药基因进一步进化传播。
　　3.本地区首次检测出CTX-M-65型ESBLs，预示本地区存在新的CTX-M型ESBLs的进化起点。提示应加强新型别ESBLs的监测与防控工作，防止院内耐药基因的传播与流行。

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中英文缩略词表

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前言

1 材料与方法

1.1 材料

1.2 方法

2. 结果

2.1 耐药菌株临床分布

2.2 ESBLs确证试验与体外药敏结果

2.3 常见耐药基因的检测结果

2.4 多重耐药菌株同源性检测

2.5 CTX-M型ESBLs氨基酸序列比对

2.6 CTX-M型ESBLs系统进化树

2.7 CTX-M型ESBLs正选择位点检测

2.8 CTX-M型ESBLs蛋白质空间结构分析

3 讨论

3.1 CTX-M型ESBLs流行性及耐药性分析

3.2 CTX-M型ESBLs分子进化路径分析

结论

参考文献

综述: CTX-M型超广谱β-内酰胺酶分子进化机制研究进展

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