叶黄素基于Nrf-2/ARE信号途径对人结肠癌HT29细胞增殖抑制作用的研究

摘要

目的：结肠癌是常见的一种威胁人类健康和生命的消化系统恶性肿瘤，具有比较高的发病率和死亡率。目前全世界新增的结肠癌患者超过百万人，其死亡率在各种恶性肿瘤中排名第三位。结肠癌的发病是多种因素共同作用的结果，并且发病速度快、隐匿性高，患者的生存周期非常短。结肠癌已经成为严重威胁病人生命的一种恶性肿瘤。目前关于结肠癌的治疗手段十分单一，主要是切除、化疗和放疗，且效果十分不理想，病人的复发率高。化学疗法常常使用5FU、丝裂霉素和甲环亚硝脲，但是临床效果尚不十分理想。故进一步地寻求有效的能够干预阻断人结肠癌发生和发展的天然植物药物具有重要的理论及实用意义。叶黄素（Lutein）是一类广泛存在于各种瓜果蔬菜中的含氧类胡萝卜素，是一种天然的抗氧化的植物化学物。叶黄素具有防治视网膜病变、色素变性、保护视力、延缓动脉硬化以及抗肿瘤等许多的生理功能。本实验室早期的实验研究已经证明了达到一定的浓度之后的叶黄素可明显抑制肝癌细胞、胃癌细胞、乳腺癌细胞以及食管癌细胞的增殖。本实验宗旨在于研究探索叶黄素对人结肠癌HT29细胞增殖的抑制作用以及探索其可能存在的分子作用机制。
　　方法：本次实验采用CCK8方法检测绘制人结肠癌HT29细胞连续8 d的生长曲线；在培养 HT29细胞的96孔培养板中加入不同浓度的叶黄素，然后分别培养24 h，48 h，72 h后，采用CCK8法检测不同浓度的叶黄素对人结肠癌HT29细胞的抑制增殖作用的影响；倒置显微镜下观察并拍照记录叶黄素对人结肠癌HT29细胞在形态学上的影响；应用流式细胞仪检测叶黄素对人结肠癌HT29细胞周期分布的影响；用不同浓度的叶黄素作用于人结肠癌HT29细胞48 h后，采用RT-PCR技术检测人结肠癌HT29细胞中Nrf-2和HO-1的mRNA的表达水平的变化情况；采用Western blot技术检测人结肠癌HT29细胞内Nrf-2和HO-1的蛋白的表达水平的变化情况。
　　结果：CCK8法检测的最终结果显示，叶黄素能够显著地抑制人结肠癌HT29细胞的增殖，并且存在着时间依赖性和剂量依赖性(P<0.01)。80 mg·L-1的叶黄素作用人结肠癌HT29细胞24、48、72 h后，抑制率分别为24.92％、45.11%、53.68%。当用160 mg·L-1的叶黄素作用人结肠癌HT29细胞24、48、72 h后，抑制率分别为30.91%、58.51%、78.09%。利用流式细胞仪检测人结肠癌HT29细胞周期的结果表明：不同浓度的叶黄素处理人结肠癌HT29细胞48h后，人结肠癌HT29细胞的细胞周期发生明显阻滞，G0/G1期的细胞数量显著增加，这说明叶黄素可以阻滞人结肠癌HT29细胞生长在G0/G1期。采用RT-PCR技术检测后的结果显示，人结肠癌HT29细胞经过不同浓度的叶黄素处理后，细胞中的Nrf-2和HO-1的mRNA的表达水平随着叶黄素的浓度的增加明显上调，且具有剂量依赖性(P<0.01)，说明叶黄素可以诱导Nrf-2和HO-1基因的mRNA的转录表达。采用Western blot技术检测的结果显示，不同浓度的叶黄素作用于人结肠癌HT29细胞48h后，细胞中的Nrf-2和HO-1的蛋白的表达水平与未经叶黄素处理的对照组相比明显上调，且具有剂量依赖性(P<0.01)。
　　结论：叶黄素能够有效的显著的抑制人结肠癌HT29细胞的增殖，其可能存在的分子作用机制与阻滞细胞周期，上调 Nrf-2/ARE信号途径中 Nrf-2和HO-1的mRNA的表达水平，上调Nrf-2和HO-1的蛋白表达水平有关。

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英文缩略词表

前言

1 实验材料

1.1 实验药品

1.2 细胞系

1.3 主要试剂

1.4 主要仪器

1.5 主要试剂的配制

2 实验方法

2.1 细胞培养

2.2 人结肠癌HT29细胞生长曲线的测定

2.3 CCK8法检测叶黄素对人结肠癌HT29细胞增殖的影响

2.4 倒置显微镜下观察叶黄素对人结肠癌 HT29细胞形态的影响

2.5 流式细胞仪检测叶黄素对人结肠癌HT29细胞周期的影响

2.6 RT-PCR检测叶黄素对人结肠癌HT29细胞内Nrf-2和HO-1的mRNA的表达变化情况

2.7 Western blot检测叶黄素对人结肠癌HT29细胞内Nrf-2和HO-1的蛋白的表达变化情况

2.8 统计学分析

3 实验结果

3.1 人结肠癌 HT29细胞生长曲线

3.2 叶黄素对人结肠癌HT29细胞的增殖抑制作用

3.3 叶黄素对人结肠癌HT29细胞形态的影响

3.4 叶黄素对人结肠癌HT29细胞周期分布的影响

3.5 RT-PCR检测叶黄素对人结肠癌HT29细胞中Nrf-2和HO-1的mRNA表达水平的影响

3.6 Western blot检测叶黄素对人结肠癌HT29细胞中Nrf-2和HO-1的蛋白表达水平的影响

4 讨论

5 结论

参考文献

综述:天然植物化学物质在肿瘤的化学预防中的作用

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