miR-195通过下调FGF2和VEGFA抑制肝癌转移

摘要

肝细胞肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是最常见的高死亡率的原发性肝癌，它是全球范围内最常见的一种恶性肿瘤。世界范围内每年有超过70万肝癌新发病例，约60万人死于肝癌，其中有超过50％的肝癌发生在中国。尽管已经实施对高危人群进行筛查，但绝大多数患者仍无法治愈，并且对于晚期患者，其中位生存期不足12个月。由于肝细胞肝癌缺乏典型的临床症状，早期诊断和治疗十分困难，同时肝细胞肝癌具有高侵袭性，而转移性肝癌几乎耐受所有常规的化疗药物，这都严重影响病人生存期。肺部是肝细胞肝癌最常见的肝外转移部位，然而其原因和机制尚不清楚。寻找肝细胞肝癌复发转移的早期标志物以及研究其转移的潜在分子机制将有助于提高肝细胞肝癌的治疗效果。
　　MicroRNA是一类长度为18～25个核苷酸的单链非编码RNA分子，现在已有超过2500个microRNA在植物、动物和病毒中被鉴定出。microRNA在细胞核内生成后，经由核转运蛋白转送到胞浆，然后被引导进入RNA诱导的沉默复合体中，通过与靶基因mRNA碱基互补配对引起靶基因mRNA降解或翻译的抑制。近几十年的研究表明microRNA在肿瘤的发生、发展及迁移过程中起到重要作用。近来，关于miR-195在肿瘤发生及癌症治疗方面作用的研究越来越多。一些研究证实过表达miR-195能够通过打靶myb显著抑制肺癌增殖、转移和侵袭。在肠癌中，miR-195通过打靶CARMA3抑制细胞增殖、克隆形成和侵袭。最近研究发现了一些与HCC相关的miR-195的靶基因，包括Wnt3a，Pcmt1，VAV2，CDC42和VEGF。
　　血管生成是指从已有的毛细血管或毛细血管后静脉发展形成新的血管，是多种恶性肿瘤生长、侵袭和转移的必要的复杂过程。FGF2和VEGFA，作为最重要的血管生成因子，已成为肿瘤等存在血管生成异常的疾病的治疗靶标。FGF2在调节血管生成、细胞分化、细胞迁移方面起重要作用，在黑色素瘤、鼻咽癌、前列腺癌等异常表达。VEGF能够刺激血管内皮细胞增殖，增加血管通透性，促进细胞迁移，在乳腺癌、肺癌、食管癌、胃癌、大肠癌中高表达。有研究表明FGF2和VEGFA在HCC组织中显著升高，但其机制尚不清楚。
　　在本实验中，我们分析肺转移细胞系的miRNA芯片，发现miR-195是与肺转移的HCC密切相关的miRNA。通过Real-time PCR技术，我们检测了92例HCC组织中miR-195的表达。通过microRNA靶基因预测软件对miR-195下游靶基因进行分析，并通过与血管相关基因进行交叉分析，鉴定出血管生成相关miR-195靶基因。然后我们利用荧光素酶报告基因实验和酶联免疫吸附实验对这一推测进行验证。此外我们采用慢病毒感染技术构建miR-195稳定转染细胞系，利用Transwell技术检测miR-195对细胞迁移和侵袭能力的影响。综上所述，我们的发现补充了对HCC转移的了解，为HCC的治疗提供了新的方向。
　　第一部分:肝癌侵袭转移相关miRNAs的筛选以及miR-195在肝癌中的表达与临床意义
　　方法:
　　1、生物信息学分析肺转移肝癌的相关miRNA。
　　2、Real-time PCR方法检测miR-195在肝癌组织中的表达水平。
　　3、统计学分析miR-195的表达水平与临床病理特征之间的关系。
　　结果:
　　1、通过肝癌组织芯片分析鉴定出肝癌细胞肺转移过程中20个降低的microRNAs和4个升高的microRNAs。
　　2、Real-time PCR结果显示miR-195在肝癌组织中的表达量显著低表达。
　　3、统计学分析发现miR-195低表达与肿瘤大小、门静脉血栓形成、TNM分期以及病人存活率有关。
　　第二部分:miR-195抑制肝癌侵袭转移的分子机制的初步探索
　　方法:
　　1、生物信息学预测与血管发生相关的miR-195的靶基因。
　　2、生物信息学分析miR-195与FGF2和VEGFA的3'UTR的结合位点。
　　3、构建3'UTR质粒，并通过荧光素酶报告基因实验验证FGF2和VEGFA是miR-195的靶基因。
　　4、利用慢病毒感染技术构建miR-195稳定转染细胞系。
　　5、ELISA实验验证miR-195对FGF2和VEGFA的调节作用。
　　6、Transwell实验检测miR-195对BEL-7402细胞系转移和侵袭能力的影响。
　　结果:
　　1、生物信息学预测发现血管生成因子FGF2和VEGFA为miR-195的靶基因。
　　2、荧光素酶报告基因实验证实FGF2和VEGFA是miR-195的靶基因。
　　3、成功构建miR-195稳定转染BEL-7402细胞系。
　　4、ELISA实验证实miR-195抑制FGF2和VEGFA的表达。
　　5、Transwell实验证实miR-195抑制BEL-7402细胞系迁移和侵袭能力。
　　结论:
　　1、miR-195在肝癌肺转移细胞系及肝癌组织中的表达明显降低。
　　2、HCC组织中miR-195的表达水平与肿瘤大小、门静脉血栓、TNM分期及总体生存期相关，预示着miR-195可以作为判断HCC患者预后的潜在指标。
　　3、miR195能够通过抑制FGF2和VEGFA的表达抑制BEL-7402细胞系迁移侵袭能力。

目录

声明

摘要

英文缩略语

引言

第一部分 肝癌侵袭转移相关MIRNA的筛选以及MIR-195在肝癌中的表达与临床意义

1．前言

2．实验材料

3．实验方法

4．实验结果

5．讨论

6．小结

参考文献

第二部分 MIR-195抑制肝癌侵袭转移的分子机制的初步探索

1．前言

2．实验材料

3．实验方法

4 实验结果

5．讨论

参考文献

全文结论

综述

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致谢