IL-6通过JAK2/STAT3信号通路诱导人腹膜间皮细胞(HPMCs)间质转分化(EMT)的作用研究

摘要

背景与目的：
　　由于腹膜透析(Peritoneal dialysis,PD)具有价格较低、操作简单方便、对患者生活方式影响少、对血流动力学影响小、交叉感染率低、可以更好的保护残余肾功能等优点，已成为越来越多ESRD患者首选的RRT方式。随着PD广泛应用和相关研究的不断深入，发现随着患者PD时间的延长，腹膜透析液的高渗透压、低 PH值、葡萄糖降解产物等生物不相容因素及反复发作的腹膜炎，将引起腹膜形态和功能的改变，最终引起腹膜纤维化(Peritoneal fibrosis,PF)，导致超滤衰竭(Ultrafiltration Failure,UFF)的发生率逐渐增加。
　　在IL-6与腹膜透析相关的研究中，发现血浆IL-6的浓度在急性期反应时增加，并与血液透析和PD患者的死亡率相关。由于IL-6在PD透出液中的浓度超过其在血浆中的浓度，表明在PD的过程中，局部的腹膜腔可以产生IL-6。有研究显示，PD治疗第一年就可以观察到PD患者腹腔和全身炎症反应的增加，且腹腔和全身的炎症反应与IL-6可能是相互关联的，PD透出液中IL-6的浓度与腹膜溶质转运率呈线性增加关系。IL-6在透出液中的浓聚是腹腔局部炎症的标志，且在腹膜炎时明显升高。
　　JAK/STAT信号通路维持人体内的多种生理过程，并同时参与多种病理过程，包括细胞的增殖、分化、凋亡，是一种重要的介导细胞因子信号转导的通路。在癌症疾病的研究中，JAK/STAT信号通路已成为肿瘤治疗的靶点，发现多种人类肿瘤如多发性骨髓瘤、前列腺癌、结直肠癌、乳腺癌等存在异常活化状态的STAT3。EMT是上皮细胞癌进展过程中的重要事件，有研究发现JAK2/STAT3通路参与调节上皮细胞之间的黏附过程，与恶性病变中细胞EMT有关。IL-6与细胞膜结合受体结合，从而激活JAK/STAT信号转导通路，实现IL-6反应基因的诱导表达。
　　本研究的目的在于探讨IL-6诱导人腹膜间皮细胞（human peritoneal mesothelial cells，HPMCs）EMT的发生过程。在不同浓度及不同作用时间的IL-6作用下，采用Western blot检测JAK2/STAT3信号通路的活化状态。使用信号通路抑制剂WP066，阻断JAK2/STAT3信号通路后，观察HPMCs细胞的EMT过程是否被阻断，进一步验证IL-6通过JAK2/STAT3信号通路诱导HPMCs的EMT过程。
　　方法：
　　1.体外培养人腹膜间皮细胞，分为四个实验组。(I)正常对照组;(II)30 ng/mL IL-6作用组;(III)50 ng/mL IL-6作用组;(IV)100 ng/mL IL-6作用组。培养5天后，使用倒置相差显微镜观察细胞形态并拍照。
　　2.使用50 ng/mL IL-6作用人腹膜间皮细胞24h、48h、72h，MTT检测细胞增殖，在酶联免疫检测仪OD490nm处测量各孔的吸光值。
　　3.设定3个实验组，分别为正常对照组，50 ng/mL IL-6组和100 ng/mL IL-6组，作用24h，荧光定量PCR检测EMT标记物（上皮表型E-cadherin、纤维表型α-SMA和α-SMA）的mRNA表达变化，Western blot检测其蛋白的表达变化。
　　4.设定4个实验组，分别使用50 ng/mL IL-6作用0h（正常对照组）、24h组、48h组、72h组，荧光定量PCR检测EMT标记物的mRNA表达变化，Western blot检测其蛋白的表达变化。
　　5.分组同3，Western blot检测不同剂量IL-6作用24h，JAK2/STAT3信号通路蛋白的活化状态。
　　6.分组同4，Western blot检测50 ng/mL IL-6作用不同时间，JAK2/STAT3信号通路蛋白的活化状态。
　　7.分别设定0（正常对照组）,2,4,6,8 and10μM浓度的WP1066，作用时间持续24h，Western blot方法检测各组 P-STAT3/STAT3的相对水平，得出WP1066的有效作用浓度。
　　8.使用WP1066阻断JAK2/STAT3信号通路，Western blot方法检测P-JAK2、JAK2、P-STAT3及STAT3的表达变化。
　　9.使用WP1066阻断JAK2/STAT3信号通路，荧光定量PCR检测EMT标记物的mRNA表达变化，Western blot检测其蛋白的表达变化。
　　10.使用WP1066阻断JAK2/STAT3信号通路，倒置相差显微镜观察各组细胞形态变化，MTT法检测细胞增殖变化。
　　结果
　　1.使用中浓度(50ng/ml)及高浓度(100ng/ml)的IL-6外源性刺激HPMCs5天，发现细胞由多角形、鹅卵石样的上皮样细胞形态向梭形、扁平星样的纤维样细胞形态改变，同时细胞间隙增宽、连接疏松，呈明显纤维样改变。
　　2.在MTT实验中，外源性使用50ng/ml的IL-6分别作用HPMCs24、48、72h，发现与同时间空白对照组相比，IL-6能够明显刺激HPMCs细胞增殖。
　　3.随着IL-6作用浓度的增高，细胞上皮表型E-cadherin蛋白和mRNA表达水平逐渐下降，纤维表型α-SMA和VEGF蛋白及mRNA表达水平逐渐增高，实验组与正常对照组相比，表达水平有统计学差异（＊P<0.05）。
　　4.使用50ng/ml IL-6作用HPMCs不同时间（24、48、72h），发现随着作用时间的延长，E-cadherin蛋白及和mRNA表达水平逐渐降低，相反的，上皮表型蛋白α-SMA和VEGF蛋白及和mRNA表达水平逐渐增高，与正常对照组相比，其差异有统计学意义（＊P<0.05）。
　　5.作用时间24h，随着IL-6作用浓度的增高，磷酸化的JAK2和磷酸化的STAT3表达水平逐渐升高，差异有统计学意义（＊P<0.05）。
　　6.IL-6作用浓度50ng/ml，随着作用时间的延长，磷酸化的JAK2和磷酸化的STAT3表达水平逐渐升高，差异有统计学意义（＊P<0.05）。
　　7.Western blot结果显示,当WP1066的浓度为10μM时，与正常对照组相比，P-STAT3表达明显减弱，差异有统计学意义（＊P<0.05）。
　　8.使用WP1066阻断JAK2/STAT3信号通路，磷酸化的JAK2和磷酸化的STAT3表达水平较正常对照组无明显变化，WP1066可阻断IL-6诱导的JAK2/STAT3通路活化状态。
　　9.阻断HPMCs细胞中JAK2/STAT3通路活化后，上皮表型E-cadherin蛋白和mRNA表达水平，纤维表型α-SMA和VEGF蛋白和mRNA表达水平，未发生明显变化，与正常对照组及抑制剂对照组相比，结果无统计学差异。
　　10.阻断HPMCs细胞中JAK2/STAT3通路活化后，细胞形态仍然呈多角形、鹅卵石样，不再呈纤维样改变。MTT检测细胞增殖，发现IL-6诱导的细胞增殖被减弱。
　　结论：
　　1.IL-6可诱导HPMCs发生EMT，其标记物的表达对IL-6有剂量依赖性和时间依赖性。
　　2.JAK2/STAT3信号通路的活化对IL-6有剂量依赖性和时间依赖性。
　　3.IL-6通过JAK2/STAT3信号通路诱导HPMCs细胞发生EMT。

目录

声明

英文缩略词表

1 引言

2 实验材料

2.1 细胞株

2.2 荧光定量PCR检测引物

2.3 主要试剂

2.4 主要仪器

2.5 主要试剂配置

3 实验方法

3.1 细胞培养

3.2 细胞形态观察

3.3 MTT法检测细胞增殖

3.4 细胞中RNA的提取

3.5 逆转录步骤

3.6 Quantitative Real-Time PCR（荧光定量PCR）

3.7 细胞中蛋白的提取

3.8 BCA法测蛋白浓度

3.9 Western Blot

3.10 统计学分析

4 实验结果

4.1 IL-6对人腹膜间皮细胞(HPMCs)形态的影响

4.2 IL-6对HPMCs的诱导增殖作用

4.3 HPMCs细胞EMT标记物表达对IL-6的剂量依赖性

4.4 HPMCs细胞EMT标记物表达对IL-6的时间依赖性

4.5 JAK2/STAT3信号通路对IL-6的剂量依赖性

4.6 JAK2/STAT3信号通路对IL-6的时间依赖性

4.7 WP1066阻断STAT3磷酸化的有效浓度

4.8 WP1066对IL-6诱导的JAK2/STAT3通路活化状态的影响

4.9 阻断JAK2/STAT3信号通路后，IL-6诱导的HPMCs细胞EMT进程的变化

4.10 阻断JAK2/STAT3信号通路后，HPMCs细胞形态的变化

4.11 阻断JAK2/STAT3信号通路后，HPMCs细胞增殖的变化

5 讨论

6 小结

参考文献

综述:TGF-β1诱导人腹膜间皮细胞间质转分化的分子机制概述

个人简介和在校期间发表论文情况

致谢