新型循环肿瘤细胞检测方法在头颈部恶性肿瘤中的临床应用

摘要

目的：
　　循环血液中活性肿瘤细胞的检测被看作是液体活检，具有动态监测的功能，在肿瘤早期诊断、个体化治疗、疗效评价、预后判断等方面具有重要的临床意义，然而由于其在血液中数量很少，循环肿瘤细胞（circlulating tumor cells,CTCs）的分离和鉴定成为临床应用的难点。复制选择性溶肿瘤腺病毒Ad11-5ETel-GFP是一种通过同源重组获得的病毒，可以选择性的在具有端粒酶活性的细胞内复制并表达绿色荧光蛋白（Green Fluorescent Protein，GFP）。本研究旨在利用该病毒捕获循环肿瘤细胞，从而建立一种可重复、简单、无创的检测方法，并对该检测方法的可靠性和临床应用价值进行探讨。
　　方法：
　　首先通过实验验证我们所建立的方法能够有效捕获到肿瘤细胞，包括：将AD11-5ETel-GFP病毒加入正常人外周血中，观察GFP在正常白细胞的表达情况；将A549(肺癌细胞系)，SKBR3（乳腺癌细胞系）分别以10、50、100个细胞三个梯度加入1ml人外周血中，建立循环肿瘤细胞的模型并检测其回收率；使用抗人CD45抗体进行细胞免疫染色，荧光显微镜下观察结果。以上结果说明本实验建立的新型检测方法能有效的捕获循环细胞。将该方法应用于头颈部恶性肿瘤的患者，收集临床标本48例，将标本中红细胞裂解，加入病毒于37℃条件下孵育24h，固定涂片后于荧光显微镜下观察计数。并分析不同临床参数头颈部肿瘤患者术前外周血CTCs的检出情况。
　　结果：
　　1.复制选择性溶肿瘤病毒不感染正常人白细胞。
　　2.分别于正常人外周血中加入的10，50,100个A549、SKBR3细胞，其检出率分别为77.5％，84.0%，80.25%；80.0%，82.5%，81.25%，应用pearson卡方检验比较两组间差异，结果显示用溶肿瘤腺病毒法检测两组不同的肿瘤细胞，其检出率无显著差异，即本实验所研究的方法对各肿瘤细胞系均敏感且回收率较高。并通过细胞免疫染色实验进一步验证所捕获的细胞为循环肿瘤细胞。
　　3.在收集的48例头颈部恶性肿瘤的临床标本中，19例患者CTCs阳性，检出率为39.6%，且CTCs的检出率与性别、年龄、肿瘤分期、肿瘤的发病部位、淋巴结转移与否等临床参数无关，与肿瘤分化程度相关，肿瘤分化越差，CTCs的检出率越高。
　　结论：
　　本研究建立了一种新型循环肿瘤细胞的检测方法，初步确定了溶肿瘤腺病毒检测CTCs的标准，并对该方法的可靠性及临床应用价值进行了评估。该方法能够特异性示踪循环肿瘤细胞，具有重要的临床应用价值。

目录

声明

中英文对照缩略词表

引言

1 实验材料

1.1 肺癌细胞系A549、乳腺癌细胞系SKBR3

1.2 AD11-5ETEL-GFP

1.3 健康成人全血由志愿者提供

1.4 主要设备

1.5 主要试剂

2 实验方法

2.1 细胞的计数

2.2 健康人全血阴性对照实验

2.3 健康人全血阳性对照实验

2.4 细胞免疫染色实验（以乳腺癌细胞系SKBR3为例）

2.5 AD11-5ETel-GFP方法检测头颈部恶性肿瘤患者CTCs

2.6 CTCs的鉴定

2.7 统计学处理

3结 果

3.1 重组腺病毒感染正常白细胞的结果

3.2 回收率实验结果

3.3 细胞免疫染色实验结果

3.4 头颈部肿瘤患者临床样本CTCs检测结果

4讨 论

4.1 建立了新型有效检测CTCs的方法

4.2 CTCs判断的标准

4.3 CTCs与临床参数的关系

4.4 头颈部恶性肿瘤的CTCs研究

4.5 CTCs与肿瘤患者预后的关系

5结 论

综述:头颈部肿瘤患者外周血循环肿瘤细胞检测及临床意义的研究进展

个人简历

致谢