细胞因子、Cacna2d1、OGDH和FH对细胞以及肿瘤细胞干性调控机制的体内外研究

摘要

肿瘤是全人类共同面临的健康威胁，越来越多的研究表明，引起肿瘤发生发展的是一小簇起决定性作用的肿瘤干细胞。肿瘤干细胞，具有巨大的自我更新和无限增殖的能力，并具有巨大的分化潜能。正常干细胞是受体内控制的，但肿瘤干细胞不受控制，可以无限增殖和转移。肿瘤的发生发展是一个多基因、多步骤、多信号通路参与的过程，从正常细胞逐步发展到肿瘤状态，细胞的特性也随之发生了变化。正如Hanahan Duglas教授研究所揭示的，具体来讲肿瘤细胞具有如下特点：1）维持增殖信号；2）逃避生长抑制因子；3）逃避免疫监视；4）无限增殖；5）促进炎症发生发展；6）激活侵袭转移；7）诱导血管生成；8）诱导基因突变；9）抗凋亡；10）warburg效应-重新编程能量代谢。肿瘤干细胞的存在也是肿瘤放化疗耐药及复发转移的主要原因。因此，对肿瘤细胞干性调节机制的研究也是肿瘤干细胞研究的重要课题之一。
　　以肿瘤细胞为研究对象，进行肿瘤干细胞的研究，是目前较为流行，也是研究比较广泛和深入的。越来越多的研究表明，肿瘤微环境对肿瘤的发生发展也起着至关重要的作用。肿瘤细胞的增殖、侵袭、转移，特别是肿瘤的血管生成和上皮向间质转化的过程中，肿瘤生存赖以维持的微环境随之发生变化，为肿瘤干细胞提供了新的研究方向和研究思路。前列腺癌最容易复发和转移到骨髓，在无进展生存期，患者并没有表现出任何与肿瘤生长相关的症状，但是此时肿瘤干细胞已经潜藏且休眠于骨髓中，说明某种情况下的骨髓微环境适宜于肿瘤干细胞的生存，但是其具体的分子生物学机制尚不清楚。本研究通过探讨来源于骨髓的不同白介素细胞因子3、6、10、11和24对前列腺癌细胞在体外的干性调节机制，进一步了解为什么前列腺癌细胞可以在骨髓中长期潜伏，为前列腺癌无病生存期的治疗提供实验基础。
　　肿瘤发生与癌基因和抑癌基因的关系密不可分，由于基因的异常激活或下调，导致正常细胞发生变异，从而逐步进化到肿瘤甚至恶性肿瘤状态。有研究表明，肿瘤干细胞是放疗和化疗失败的主要原因，目前已经发现大量的肿瘤干细胞标记物，如 CD44、ABCG2、SOX2、NANOG、CD133等。研究表明，通过流式细胞仪的分选等技术手段，结合肿瘤标记物可有助于帮助检测肿瘤干细胞，实现早期诊断肿瘤，或者富集肿瘤干细胞，研究临床有效的靶向药物。因此非常有必要筛选出有临床价值的肿瘤标志物。我们实验室通过系列的基因敲除和线粒体功能抑制手段，建立了一系列慢周期高干性的前列腺癌和卵巢癌的细胞系，这些细胞都表现出特殊的肿瘤干细胞特性，并且对化疗和放疗高度不敏感。我们通过对这些细胞进行转录组深度测序，证明肿瘤干细胞因子Cacna2d1在这些细胞系中高表达，因此我们决定研究Cacna2d1在卵巢癌组织中的表达及其与临床预后的相关关系，探索Cacna2d1在卵巢癌的诊断和治疗方面的可能性。
　　肿瘤在体内的发生发展是一个多通路交叉、多因素相互影响的复杂结构体，体外模拟培养肿瘤细胞，便于直观观察和研究，但是由于整个生命有机体是一个系统，结构更加复杂，使得细胞研究存在一定的局限性。虽然线粒体有完整的双层膜保护，但他们仍然易受内部和外部的有害刺激，诸如毒性药物和氧化应激等。研究发现，强烈的线粒体受损易导致细胞凋亡或坏死，但若受损的线粒体细胞被持续携带遗传，则会导致严重的代谢紊乱，表现出“Warburg效应”。研究已经证实，肿瘤干细胞最为显著的特点在于其与正常细胞不同的能量代谢途径—“Warburg效应”。1956年，Dr. Otto Warburg首次提出，癌细胞在有氧存在的情况下，依然产生持续增高的葡萄糖摄取率和乳酸产量，表明肿瘤细胞优先选择有氧糖酵解代谢途径。研究发现，Warburg效应给予肿瘤细胞更有利的生长优势，包括更快的生产ATP、更迅速的使氨基酸合成为蛋白质及核酸的DNA复制，合成细胞增殖所需的脂质细胞生物膜以及产生酸性环境等，这对正常细胞是有害的，但是对肿瘤细胞却是有益的，可产生较少的活性氧，从而使癌细胞逃避高浓度活性氧的损害，诱导肿瘤细胞抗凋亡。更为重要的是，研究已经注意到，线粒体呼吸相关酶的遗传改变与癌症的发生发展密切相关，代谢障碍诱导细胞干性上调，诱发肿瘤。研究已经发现突变的延胡索酸脱氢酶 fumarate hydratase, FH）与遗传性平滑肌瘤病和肾细胞癌（ carcinomas arising in the hereditary leiomyomatosis renal cell carcinoma syndrome, HLRCC）密切有关。基于此，开展线粒体内三羧酸循环代谢通路的研究，从代谢途径找到靶向肿瘤干细胞的突破口，有可能是一个有前景且具有特定靶向意义的治疗策略。因此，为了更加深入透彻的探究肿瘤干细胞的作用机制，本研究采用TALEN基因编辑技术，构建α-酮戊二酸脱氢酶（α-oxoglutarate dehydrogenase, OGDH）和延胡索酸脱氢酶基因缺陷型大鼠，在体内破坏三羧酸循环代谢通路，迫使细胞进行有氧糖酵解，从而探讨其启动肿瘤干细胞、诱发肿瘤发生发展的作用机制。
　　综上所述，在细胞生物学方面，我们针对肿瘤微环境，研究来源于骨髓的白介素细胞因子3、6、10、11和24对前列腺癌细胞干性的影响；在临床方面，采用免疫组织化学法，分析肿瘤干细胞样标记物Cacna2d1对238例卵巢癌组织样本临床表型及预后的影响，探讨其与卵巢癌的临床诊断和治疗的潜在价值；在体内研究方面，采用 TALEN基因编辑技术，建立 SD大鼠三羧酸循环（tricarboxylic acid cycle, TCA）关键酶OGDH和FH的基因敲除动物模型，以期进一步探讨TCA循环障碍与肿瘤发生发展的作用机制，为更好的研究肿瘤的发生发展提供稳定可持续的动物模型。总之，为了更加深入透彻的了解肿瘤干细胞的作用机制，本研究着眼于细胞、临床和动物体内三个不同阶段，展开了全面深入的研究，以期阐明细胞以及肿瘤细胞干性调节的因素及作用机制。
　　第一部分细胞因子白介素3、6、10、11和24对前列腺癌细胞干性调控的影响
　　研究方法
　　1.检测不同白介素细胞因子对前列腺癌LNCaP和PC-3细胞生长增殖影响的最佳浓度；
　　2.划痕实验检测细胞因子白介素3、6、10、11和24对细胞迁移能力的影响；
　　3. Transwell实验检测细胞因子白介素3、6、10、11和24对细胞伸展及侵袭能力的影响；
　　4.流式细胞仪检测细胞因子白介素3、6、10、11和24对细胞凋亡的影响，及其对前列腺癌LNCaP和PC-3细胞化疗敏感性的影响；
　　5. RT-PCR和Western Blot分别在基因水平和蛋白水平检测细胞因子白介素3、6、10、11和24对肿瘤干细胞标记物SOX2的影响，采用细胞免疫荧光技术检测SOX2在细胞的定位，并验证其蛋白表达水平的变化；
　　6.克隆形成实验检测细胞因子白介素3、6、10、11和24对前列腺癌干性调控的影响；
　　7.流式细胞仪检测细胞因子白介素3、6、10、11和24对肿瘤干细胞标记物CD44和ABCG2表达的影响。
　　研究结果
　　1.白介素3、6和11显著促进前列腺癌LNCaP和PC-3细胞的生长和增殖，而白介素10和白介素24则显著抑制前列腺癌LNCaP和PC-3细胞的生长和增殖，且其最佳浓度均为5ng/ml；
　　2.划痕实验和Transell实验表明白介素3、6和11显著增强前列腺癌LNCaP和PC-3细胞迁移、伸展和侵袭能力，而白介素10和白介素24则显著降低细胞的迁移、伸展和侵袭能力。
　　3.流式细胞仪结果显示白介素3、6和11增强细胞的抗凋亡能力，且增强化疗耐药性，同时增加干细胞标记物CD44和ABCG2的表达，而白介素10和白介素24则显著诱导细胞凋亡，并增强化疗敏感性，降低干细胞标记物CD44和ABCG2的表达；
　　4.白介素3、6和11显著增强干细胞标记物SOX2在基因水平和蛋白水平的表达，并增强细胞的克隆形成能力，而白介素10和白介素24则显著抑制SOX2的表达，并抑制细胞克隆形成能力；
　　5.应用SPSS22.0软件，两组数据之间的比较采用t检验，多组数据之间的比较采用单因素方差分析，P<0.05被认为差异具有统计学意义。
　　第二部分肿瘤干细胞因子Cacna2d1对卵巢癌临床表型及预后的影响
　　研究方法
　　1.采用免疫组织化学法检测238例卵巢癌组织中Cacna2d1的表达水平及细胞定位；
　　2.分析Cacna2d1蛋白表达与临床病理学特征以及患者生存期之间的关系。
　　3.应用SPSS22.0软件，采用单因素方差分析检测Cacna2d1表达与各临床病理学特征之间的关系；中位数和生存曲线采用 Kaplan-Meier法，组间差异用log-rank分析检验，多因素分析采用Cox回归方法进行探讨。在所有的分析中，P值<0.05被认为差异具有统计学意义。
　　研究结果
　　1.在238例卵巢癌组织中，有199例（83.6％）Cacna2d1表达阳性，主要表达于卵巢癌的细胞膜/细胞质中，且高表达于卵巢癌细胞侵袭前沿。阳性表达样本中，107(44.9%)例弱表达，92(38.7%)例高表达。其中的158例浆液性卵巢癌中，148(93.7%)例表达阳性，88(55.7%)例弱表达，60(38.0%)高表达Cacna2d1。
　　2.在卵巢癌组织样本中，Cacna2d1表达与卵巢癌分期、病理学类型和分化程度密切相关；在浆液性卵巢癌组织样本中，Cacna2d1的表达与卵巢癌分期和分化程度密切相关。
　　3.肿瘤干细胞因子 Cacna2d1高表达与差的卵巢癌预后（包括无进展生存期和总生存期）密切相关。
　　第三部分 OGDH和FH基因敲除SD大鼠的构建
　　研究方法
　　1.采用TALEN基因编辑技术，设计、构建TALEN质粒，靶向敲除SD大鼠的OGDH和FH基因，用荧光素酶活性法筛选出最有效质粒，显微注射法将质粒打入SD大鼠的受精卵后测序鉴定。
　　2.在同一时间点对野生型和基因敲除型大鼠分别进行饮食习惯、活动状态、毛发颜色的观察及定时的体重测量。
　　3. Western Blot检测野生型和基因敲除型SD大鼠肝组织中OGDH的蛋白表达水平。RT-PCR和Western Blot分别检测野生型和基因敲除型SD大鼠心、肝、肺、肾、脑、脾、胃、睾丸中FH在基因水平和蛋白水平的表达情况。
　　4.提取肺原代成纤维细胞，细胞免疫荧光检测细胞中FH基因的表达情况。
　　5. DNA测序检测孕早期和孕晚期SD大鼠中FH基因在胚胎的表达情况。
　　6.分别检测野生型和FH基因敲除型SD大鼠的血常规、血生化，分析敲除FH基因对血液临床指标的影响，并采用血涂片技术，检测血细胞的变化。
　　7. HE组织学检测野生型和FH基因敲除型SD大鼠肾组织的病理变化，免疫组织化学法检测两者肾组织中Ki67、p53和SOX9的表达情况。
　　研究结果
　　1.成功构建了靶向OGDH和FH基因的TALEN质粒，并筛选了最有效的TALEN质粒对，测序证实成功敲除OGDH基因第一外显子的8个碱基和FH基因第一外显子的11个碱基，两者测序均为基因敲除杂合子型。
　　2.与野生型动物相比，OGDH和FH基因SD敲除型大鼠配对的出生率显著降低。体重观察结果显示，基因敲除型大鼠的体重明显高于野生型，尤其是雄性大鼠的体重显著增高。
　　3. Western Blot结果表明，OGDH基因敲除型SD大鼠的肝组织样本中，OGDH的蛋白表达水平显著下降。RT-PCR和Western Blot结果显示FH基因敲除型大鼠的心、肝、肺、肾、脑、脾、胃、睾丸中 FH在基因水平和蛋白水平的表达均有不同程度的下降。
　　4.免疫荧光证实，与野生型相比，原代肺成纤维细胞中 FH蛋白的表达水平显著下降。
　　5.养育至第四代 FH基因敲除 SD大鼠均未发现有纯合子的出生，同时胚胎测序也均未发现FH基因敲除纯合子的存在。
　　6.血常规检测显示白细胞计数、血小板亚积、单核细胞、淋巴细胞和嗜酸粒细胞数均增高，血生化结果提示 FH基因敲除型 SD大鼠的血尿素氮和肌酐水平均显著增高，而血尿酸水平显著下降，以上均提示 FH基因敲除型大鼠的肾脏出现病理变化。
　　7.更深入的研究发现，与野生型相比，FH基因敲除型大鼠的肾脏组织存在严重的病理变化：肾髓质小灶部分存在间质性病变，细胞核大、深染，具有多形性，染色质增粗。免疫组化结果显示，与野生型相比，FH基因敲除型SD大鼠肾组织的Ki67、p53和SOX9的表达水平均显著增高。
　　研究结论
　　1.白介素3、6和11促进前列腺癌LNCaP和PC-3细胞的生长增殖、迁移和侵袭能力，并通过上调肿瘤干细胞标记物SOX2、CD44和ABCG2的表达，增强细胞的化疗耐药性及抗凋亡和克隆形成能力，表明白介素3、6和11刺激前列腺癌细胞后，可显著上调前列腺癌细胞的干性程度。而白介素10和白介素24的作用则相反，其通过下调前列腺癌细胞的干性程度，抑制细胞生长增殖、迁移、侵袭、抗凋亡和克隆形成能力，是前列腺癌的抑癌影响因子。
　　2.临床研究结果显示肿瘤干细胞因子 Cacna2d1的高表达与卵巢癌的临床分期密切相关，与卵巢癌预后差显著相关，强烈提示 Cacna2d1有可能是新的有前景的卵巢癌预后监测标记物。
　　3.构建OGDH和FH基因敲除型大鼠，破坏正常的三羧酸循环代谢途径，迫使细胞进行有氧糖酵解，进而上调细胞的干性，初步发现FH杂合子大鼠的肾上皮细胞在出生后的6个月后有癌前病变样转化，而且区域性的肾上皮细胞高表达Ki67、p53和SOX9。且FH基因的完全敲除都具有胚胎致死性。我们的研究结果初步提示，细胞长期具有Warburg异常糖代谢，可能是肿瘤发生的基础之一。本研究可作为研究 Warburg效应和肿瘤发生发展，以及Warburg效应与肿瘤干细胞相互关系的动物模型。

目录

声明

中英文缩略词对照表

引言

第一部分 细胞因子ILs-3, 6, 10, 11, 24对前列腺癌细胞干性调控的影响

前言

1 材料与试剂

2 实验方法

3 实验结果

4 讨论

第二部分 肿瘤干细胞因子Cacna2d1对卵巢癌临床表型及预后的影响

前言

1 材料与试剂

2 实验方法

3 结果

4 讨论

第三部分 OGDH和FH基因敲除SD大鼠的构建

前言

第一章 构建OGDH基因敲除型SD大鼠模型

第二章 FH基因敲除型SD大鼠模型的构建及其生物学行为的影响

全文总结

参考文献

综述:肿瘤干细胞干性调控因素研究进展

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致谢