人脐带间充质干细胞联合白藜芦醇对阿尔茨海默鼠的干预及SIRT1分子信号的调控

摘要

阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)是一种进行性发展的神经系统退行性疾病,病理典型病变为脑内淀粉样沉积、纤维样缠绕、神经元凋亡与缺失。AD是最常见的痴呆类型，临床表现为进行性学习记忆能力下降、失语、失用、失认、视空间技能损害、执行功能障碍以及人格和行为改变，并可危及生命，严重影响病人及家人生活质量。中国目前约有600万AD病人，此数据还在不断递增，预计到2050年将达到2000万。然而，目前AD病因和发病机制尚不明确，也无有效的治疗方案。
　　干细胞具有自我更新和多向分化的潜能，是再生医学中的研究焦点。人脐带间充质干细胞（ human umbilical cord derived Mesenchymal stem cells， hUC-MSCs）来源于脐带，具有取材方便、免疫原性低、适用于自体和异体移植等优点，而且，与胚胎干细胞相比，hUC-MSCs不存在伦理争议、无畸胎瘤的风险，因此，具有较好的临床应用前景。此外，MSCs体外扩增能力较强、具有神经样细胞分化的潜能，并能够分泌多种神经营养因子，为AD的神经再生与修复提供希望。但是，研究发现体外培养的干细胞随传代、扩增发生一系列形态和功能的改变，移植到体内的干细胞受微环境的影响存活、定位和功能发挥也受到限制，因此，如何调控干细胞体内外的生物学特性和功能对干细胞的研究和应用具有重要的意义。
　　白藜芦醇是天然的植物抗毒素，存在于葡萄、花生、虎杖、藜芦、决明等植物中的非黄酮类多酚化合物。研究发现，白藜芦醇可通过调控SIRT1( silent mating type information regulation2 homolog1)的活性与表达水平进而对细胞、组织和机体的抗氧化、能量代谢、衰老和内环境稳态等多方面生物学特性发挥重要的调控作用。SIRT1即Sirtuin1(silent mating type information regulation2 homolog)1是NAD+依赖的去乙酰化Sirtuins家族成员之一，在一定条件诱导下，可在细胞核与细胞质之间穿梭，调控细胞的增殖、分化、氧化应激等。动物实验中也发现白藜芦醇及SIRT1信号对神经修复和再生具有促进作用。但是SIRT1表达随细胞和机体衰老而下降，有研究者提出，SIRT1可作为AD早期诊断的标记物和治疗的分子靶点，然而，白藜芦醇是否能够通过 SIRT1分子信号在体内外调控MSCs的命运，白藜芦醇联合hUC-MSCs是否能更好地促进其神经再生、改善学习记忆、干预AD鼠的病理进程有待研究探讨。
　　目的
　　明确不同剂量白藜芦醇对 hUC-MSCs体外增殖、神经分化、衰老、细胞周期和凋亡作用的量效关系，以及 SIRT1信号相关分子的改变。分析白藜芦醇联合hUC-MSCs移植对转基因AD鼠脑内hUC-MSCs存活和迁移的影响，确定白藜芦醇联合hUC-MSCs移植对AD鼠的行为学、病理学以及SIRT1信号分子的调控，为优化AD疗效提供新思路。
　　方法
　　1、体外实验研究白藜芦醇对hUC-MSCs自我更新和神经样分化及SIRT1信号分子表达的影响
　　无菌条件下收集新生儿脐带，体外分离、培养、鉴定和冻存hUC-MSCs。采用不同浓度的白藜芦醇（0.1、1、2.5、5、10μmol/L）刺激第四代hUC-MSCs6天后，CCK-8试剂盒检测细胞活性；EdU染色法检测细胞增殖；PI染色、Annexin V-FITC/PI染色及流式细胞仪术检测细胞周期和凋亡；β-半乳糖苷酶染色检测细胞衰老；qRT-PCR和 Western Blotting检测细胞SIRT1及下游分子PCNA、p53、p21和p16的表达；多步法诱导hUC-MSCs神经分化后，细胞免疫荧光法检测神经标记物Nestin、βIII-tubulin、NSE的表达；qRT-PCR检测神经转录因子Ngn1、Ngn2、Mash1的表达。
　　2、体内实验探索白藜芦醇联合hUC-MSCs移植对AD鼠的干预效果以及脑内SIRT1信号分子表达的影响
　　APP695V717I转基因AD小鼠饲养、繁殖、鉴定并分组。共分为6组，每组15只：对照组（WT），APP695V717I转基因小鼠组（AD）、hUC-MSCs移植组（MSCs）、白藜芦醇预处理hUC-MSCs移植组（RES-MSCs）、白藜芦醇灌胃联合hUC-MSCs移植组（MSCs+RES）、白藜芦醇灌胃组（RES）。治疗8周后， Morris水迷宫检测小鼠的学习记忆能力；免疫组化检测小鼠脑内 hUC-MSCs的存活、APP的表达、神经再生标记物Nestin、βIII-tubulin的表达、小胶质细胞Iba1和星形胶质细胞GFAP的表达；TUNEL检测小鼠神经细胞凋亡；比色法测小鼠血清超氧化物歧化酶（ Superoxide dismutase, SOD）活性以及脂质过氧化物（Malondialdehyde, MDA）含量；Western Blotting检测磷酸化Tau蛋白的表达；qRT-PCR检测海马内神经营养因子（BDNF、NGF和NT-3）以及炎症因子（TNF-α、IL-1β和 IL-10）的表达变化；qRT-PCR和Western Blotting检测海马组织中SIRT1、PCNA、p53、acetylized-p53（ac-p53）、p21和p16的表达情况。
　　结果
　　1、体外实验结果显示：白藜芦醇对hUC-MSCs的细胞活性、增殖、衰老、凋亡、细胞周期、神经分化以及 SIRT1信号分子的调节具浓度依赖性调节作用。
　　1.1 CCK8结果显示：与对照组相比，0.1、1、2.5μmol/L白藜芦醇处理6天活性细胞数目显著增加（P<0.05），而5和10μmol/L白藜芦醇处理6天活性细胞显著减少（P<0.05）。
　　1.2 EdU结果显示：与对照组相比，0.1、1、2.5μmol/L白藜芦醇处理6天促进hUC-MSCs细胞增殖（P<0.05），而5和10μmol/L白藜芦醇处理6天则抑制细胞增殖（P<0.05）。
　　1.3 PI染色结果显示：与对照组相比，0.1、1、2.5μmol/L白藜芦醇处理6天对hUC-MSCs使细胞S和G2/M期细胞增多，G0/G1期细胞减少，但差异无统计学意义（P>0.05）。但5和10μmol/L白藜芦醇处理6天则使细胞S期细胞显著增多，伴随 G0/G1期细胞减少（P<0.05）。
　　1.4 Annexin V-FITC/PI染色显示：与对照组相比，0.1、1、2.5μmol/L白藜芦醇处理6天使hUC-MSCs凋亡率下降但是差异无统计学意义（P>0.05），而5和10μmol/L白藜芦醇处理6天则使hUC-MSC凋亡率升高（P<0.05）。
　　1.5β-半乳糖苷酶染色显示：与对照组相比，0.1、1、2.5μmol/L白藜芦醇处理6天抑制hUC-MSCs衰老（P<0.05），而5或10μmol/L白藜芦醇处理6天则促进衰老（P<0.05）。
　　1.6免疫荧光和qRT-PCR结果显示：与对照组相比，0.1、1、2.5、5、10μmol/L白藜芦醇预处理6天均下调Nestin、NgN1表达，上调NSE、βIII-tubulin、Ngn2、Mash1表达，促进hUC-MSCs向神经细胞分化，并随浓度增加作用增强（P<0.05）。
　　1.7 Western Blotting结果显示：0.1、1、2.5μmol/L白藜芦醇处理6天上调hUC-MSCs SIRT1和PCNA表达，下调p53和p16的表达（P<0.05）；而5和10μmol/L起相反作用。0-10μmol/L白藜芦醇刺激对 p21表达无显著差异（P>0.05）。
　　2、体内结果显示：hUC-MSCs和白藜芦醇能协同改善AD小鼠病理，提高学习记忆能力功能，调节SIRT1信号分子
　　2.1行为学改变:hUC-MSCs和白藜芦醇都能改善AD小鼠学习记忆能力，表现为：与AD组相比，治疗组小鼠到达平台的潜伏期缩短，穿越平台次数增多，目的象限停留时间增长， MSCs+RES组效果最好，差异具有统计学意义（P<0.05）。
　　2.2免疫组化结果显示：与MSCs组相比，RES-MSCs组和MSCs+RES组脑内可检测到更多的移植hUC-MSCs（P<0.05）。
　　2.3病理学改变：hUC-MSCs和白藜芦醇协同减轻AD小鼠脑内APP蛋白高表达（P<0.05），Tau蛋白过磷酸化（P<0.05）和神经凋亡，表现为 TUNEL+细胞减少（P<0.05），MSCs+RES组效果最好，差异具有统计学意义（P<0.05）。
　　2.4 hUC-MSCs和白藜芦醇协同促进海马齿状回神经再生，表现为：治疗组神经再生标记物Nestin、βIII-tubulin的表达增强，MSCs+RES组效果最佳，差异具有统计学意义（P<0.05）,此结果可能与 hUC-MSCs和白藜芦醇协同上调海马内神经营养因子BDNF、NGF、NT-3表达相关（P<0.05）。
　　2.5 hUC-MSCs和白藜芦醇协同调控海马部位炎症细胞反应，表现为：治疗组Iba1+小胶质细胞细胞减少，GFAP+星形胶质细胞增多，其中MSCs+RES组效果最佳，差异具有统计学意义（P<0.05）。而且hUC-MSCs和白藜芦醇协同下调致炎因子 TNF-α、IL-1β表达，上调抗炎因子 IL-10的表达（ P<0.05）, MSCs+RES组改变最大，差异具有统计学意义（P<0.05），此结果进一步证明hUC-MSCs和白藜芦醇对海马炎症的调节作用。
　　2.6 hUC-MSCs和白藜芦醇协同调节氧化应激反应，表现为血清SOD活性升高（P<0.05）和MDA含量下降（P<0.05）, MSCs+RES组差异最显著（P<0.05）。
　　2.7 hUC-MSCs和白藜芦醇协同调节脑内SIRT1分子信号，表现为：海马组织中SIRT1、PCNA表达升高，p53、ac-p53、p21和p16的表达下降（P<0.05）, MSCs+RES组改变最显著，差异具有统计学意义（P<0.05）。
　　结论
　　1、白藜芦醇对hUC-MSCs的自我更新和神经分化具有浓度依赖性作用，低浓度（0.1、1、2.5μmol/L）白藜芦醇刺激6天可通过促进细胞增殖、抑制细胞衰老、上调SIRT1和PCNA并下调p53和 p16表达下降表达使活性细胞增多，对细胞自我更新产生促进作用；而高浓度（5、10μmol/L）白藜芦醇则通过抑制细胞增殖、导致S期阻滞、加速细胞衰老与凋亡，下调SIRT1和PCNA表达、上调p53与p16表达，导致活性细胞减少，抑制细胞自我更新。此外，0.1-10μmol/L白藜芦醇对 hUC-MSCs神经样分化具有浓度依赖性促进作用。白藜芦醇对hUC-MSCs生物学特性浓度依赖性调控对其科研和临床应用具有指导意义。
　　2、白藜芦醇促进hUC-MSCs在AD小鼠脑内的迁移与存活；白藜芦醇联合hUC-MSCs能更有效地降低 APP表达、Tau磷酸化水平、海马神经细胞凋亡、氧化应激损伤，改善AD病理状态；白藜芦醇和hUC-MSCs协同调节脑内炎症细胞与炎性因子；促进神经生长因子的表达和海马神经再生；提高AD小鼠的学习记忆能力。白藜芦醇联合hUC-MSCs对有望成为更有效的治疗AD的手段，其分子机制与SIRT1分子信号中 SIRT1、PCNA、ac-p53、p53、p21、p16表达的改变相关。

目录

声明

缩略词

引言

参考文献

第一部分 白藜芦醇对人脐带间充质干细胞自我更新、神经样分化以及SIRT1分子信号的调控

前言

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

4 小结

参考文献

第二部分 hUC-MSCs移植联合白藜芦醇对阿尔茨海默小鼠的干预及SIRT1分子信号的调控

前言

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

4 小结

参考文献

综述:干细胞治疗阿尔茨海默病的研究进展与应用前景

个人简历及博士期间发表的学术论文

致谢