Fe3O4磁性壳聚糖微球固定化脂肪酶研究

摘要

脂肪酶是一种重要的生物催化剂，可催化水解、酯交换等多种化学反应，应用十分广泛。但游离酶存在价格昂贵、反应后酶回收困难等问题制约着脂肪酶的工业化应用。于是酶的固定化研究成为该领域的研究热点。磁性壳聚糖微球具有易回收，表面易修饰等优点，在固定化酶的研究中应用十分普遍。采用接枝化的方法能够减少空间位阻效应对酶负载量和游离性的影响，同时接枝化修饰也可以提高壳聚糖在水中的分散性。本文重点研究了叠氮化的磁性壳聚糖微球载体的制备，并以磁性壳聚糖微球为载体固定化猪胰腺脂肪酶，采用响应面试验设计对固定化条件进行优化，旨在为脂肪酶的工业化应用奠定理论基础。
　　首先，制备以Fe3O4和壳聚糖为基质的磁性壳聚糖微球，考察壳聚糖与Fe3O4质量比、戊二醛用量、反应时间和搅拌速率对磁性壳聚糖微球的粒径的影响。结果表明：Fe3O4与壳聚糖质量比为1:1.5、戊二醛用量1mL、反应时间1.5h、搅拌速率500r/min时，为制备磁性壳聚糖微球的最佳工艺条件；对制备出的磁性微球进行接枝，优化得到接枝率最大时的反应条件为丁二酸酐加入量0.6g，4-二甲基氨基吡啶加入量0.5g，反应时间8h。最后，将接枝后的磁性壳聚糖微球进行叠氮化，并以载酶量为依据考察酰肼化条件，得到酰肼化时间为8h时，载酶量达到最大。
　　接着，以叠氮化磁性壳聚糖微球为载体，进行猪胰腺脂肪酶固定化研究，采用Design Expert软件对酶固定化进行试验设计，以酶浓度、反应时间、反应温度和pH值为考察因素，以载酶量和相对酶活为响应值，设计出四因素三水平的29组试验，并对实验数据进行分析得出最优固定化条件。结果表明：以载酶量为考察指标时，最优的固定化条件为酶浓度4.0mg/mL，反应时间8.4h，反应温度39.3℃和pH7.0，酶负载量预测值68.6mg/g。为了验证预测结果的准确性，在最佳条件下进行酶固定化重复试验，三次结果平均值为64.37mg/g，与预测值接近；对相对酶活的考察中，说明该模型可用于实验预测。以相对酶活为考察指标时，优化的最佳条件为酶浓度3.0mg/mL，反应时间4.9h，反应温度35.8℃， pH7.5，相对酶活预测值为85.03％。在该较优条件下进行了三组平行实验，测得相对酶活为83.24%，与预测值相近。
　　本文采用扫描电镜，透射电镜和红外光谱等现代化分析手段对磁性壳聚糖微球进行了结构表征。Fe3O4磁性壳聚糖微球可以固定化脂肪酶。

目录

声明

1 绪论

1.1 脂肪酶概述

1.1.1 脂肪酶的来源

1.1.2 脂肪酶结构与催化机理

1.2 脂肪酶的应用

1.2.1 水解反应

1.2.2 合成反应

1.3 酶的固定化概述

1.4 酶固定化方法

1.4.1 吸附法

1.4.2 包埋法

1.4.3 共价法

1.4.4 交联法

1.5 载体的研究

1.5.1 传统载体

1.5.2 新型负载材料

1.6 选题思想与研究意义

2 磁性壳聚糖微球载体的制备

2.1 引言

2.2 实验材料与仪器

2.2.1 材料与试剂

2.2.2 仪器

2.3 实验方法

2.3.1 磁性壳聚糖微球载体的合成

2.3.2磁性壳聚糖微球的表征方法

2.4 结果与讨论

2.4.1 磁性壳聚糖微球制备工艺条件优化

2.4.2 磁性壳聚糖微球接枝工艺条件优化

2.4.3 磁性壳聚糖酰肼化优化

2.4.4 磁性壳聚糖微球表征

2.5 小结

3 叠氮化磁性壳聚糖微球固定化猪胰腺脂肪酶研究

3.1 引言

3.2 实验试剂与仪器

3.2.1 实验试剂

3.2.2 实验仪器

3.3 实验方法

3.3.1 粗酶溶液的提取

3.3.2 脂肪酶固定化

3.3.3 酶蛋白含量的测定

3.3.4 载酶量分析

3.3.5 脂肪酶活力的测定

3.3.6 固定化脂肪酶的重复使用活性研究

3.4 结果与讨论

3.4.1 酶浓度标准曲线

3.4.2 响应面法实验设计

3.4.3 载酶量分析

3.4.4 相对酶活性分析

3.4.5 最优化条件检测

3.4.6 重复利用性检测

3.5 小结

4 结论与展望

参考文献

个人简历及发表论文

致谢