二苯并环辛二烯类化合物DC9体外抗HBV作用研究

摘要

目的:
　　据世界卫生组织（World Health Organization，WHO）报告，乙型肝炎是威胁全人类健康的一种严重的传染性疾病。据统计2017年全球大约有2.57亿HBV(Hepatitis BVirus)s抗原阳性者，由感染引起的肝硬化、肝癌及其他相关性疾病导致的死亡人数达88.7万。目前，用于治疗慢性乙型肝炎的方法主要有四种，分别是基因治疗、免疫治疗、抗病毒治疗及保肝治疗。在诸多的治疗方法中，抗病毒治疗仍然是重中之重。现在，临床用于乙肝治疗的药物主要包括干扰素、核苷（酸）类似物、非核苷类药物以及中草药等，但这些药物长期应用会出现较严重的毒副作用或产生耐药，且价格昂贵。另外虽然联合用药比单一用药更能降低HBV感染者的发病率和死亡率，但长期联合用药导致的多药耐药等问题的出现，更加限制了抗HBV药物的使用，给临床工作者带来了更加巨大的挑战。因此，不断探索开发安全、有效的新型抗HBV药物是医药研究者当务之急的工作。
　　从天然资源中寻找新的抗HBV药物或者先导化合物的研究是国内外新药研制中比较活跃的领域之一，也是创制新药的一种捷径。二苯并环辛二烯类(Dibenzo cyclooctadiene，DC)化合物是从五味子科植物中提取出来的一类具有镇咳、抗肿瘤、抗HBV等生物活性的化合物。DC系列10个化合物是对二苯并环辛二烯进行结构改造的一系列化合物，目的是使其能够更好地发挥抗HBV效果，为临床慢性乙型肝炎的治疗提供帮助。本论文的研究目的是从DC系列中筛选出具有抗病毒活性的化合物，然后对活性化合物的抗HBV机制进行初步研究，以期为其进一步能够应用于临床提供实验依据。
　　方法:
　　本课题采用HBV基因转染的人肝癌细胞HepG2.2.15细胞为筛选模型，以HBsAg和HBeAg为指标对DC系列10个化合物进行体外抗HBV活性筛选，对筛选出有抗HBV活性的化合物，进一步检测对细胞上清液及细胞内HBVDNA拷贝数的影响，并初步研究其作用机制。其内容如下:
　　通过甲基偶氮唑盐比色分析法(MTT)检测化合物对HepG2.2.15细胞的毒性，计算细胞的半数毒性浓度(TC50);酶联免疫吸附法(Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)检测用药物作用于细胞6天后的细胞上清液中的HBsAg、HBeAg的变化，计算药物对抗原分泌的的半数抑制浓度(IC50);以治疗指数(Therapy Inedx，TI)为指标，其中TI=TC50/IC50，评价10种受试物的体外抗HBV活性，由此确定DC9为活性化合物。
　　通过实时荧光定量聚合酶链反应法(Quantitative Real-time PCR,FQ-PCR)检测DC9作用于细胞3、6、9天后，化合物对细胞内及细胞上清中HBV DNA拷贝数的影响，计算出DC9对HepG2.2.15细胞上清液中及细胞内HBV DNA拷贝数的抑制率，根据与阳性药物的比较，判断其体外抗HBV效果。采用逆转录聚合酶链反应法(Reverse Tanscription PCR，RT-PCR)检测DC9对HepG2.2.15细胞HBV聚合酶(Polymerase，P)基因mRNA表达活性的影响。
　　结果:
　　1:通过筛选，有2种受试药物对HBV HBsAg的TI＞1，对HBeAg的TI＞1只有DC9，确定DC9为活性化合物。
　　2:DC9在体外对HepG2.2.15细胞毒性偏小，其TC50＞400μM;对HBsAg和HBeAg分泌的半数抑制浓度(IC50)分别为54.49和28.17μM，治疗指数(TI)分别为＞7.34和＞14.2;对细胞上清液中和细胞内HBV DNA拷贝数的抑制率具有浓度依赖性和时间依赖性;RT-PCR检测结果表明，高剂量DC9对HBV P基因的mRNA表达抑制作用与正常组相比，差异具有显著性(P＜0.01)，并且抑制作用强于阳性药3TC对照组。
　　结论:
　　1、通过对10种受试物的抗HBV活性筛选，发现1种受试物DC9有明显体外抗HBV活性。
　　2、DC9具有明显的抗HBV的作用，其作用不仅抑制HBV分泌HBsAg、HBeAg，同时还抑制HBV DNA复制，在转录水平抑制HBV P基因mRNA的表达。

目录

声明

摘要

缩写词对照表

引言

1 实验材料与仪器

1．1．HepG2．2．15细胞株

1．2．药物与试剂

1．3 实验仪器

1．4 试剂和药物的配制

2 实验方法

2．1 HepG2．2．15细胞的复苏、培养和冻存

2．2 MTT法测定各受试物对HepG2．2．15细胞的毒性

2．2．1 细胞铺板

2．2．2 MTT检测

2．3 ELISA法测定受试物对HBeAg和HBsAg的影响

2．4 判断受试物的抗HBV效果

2．5．1 细胞及上清液的收集

2．5．2 上清液DNA检测

2．6 荧光定量PCR法测定DC9对细胞内HBV DNA拷贝数的影响

2．7 RT-PCR法检测DC9对HBV P基因mRNA的表达水平的影响

2．7．1 试剂盒器皿处理总RNA提取

2．7．2 细胞收集

2．7．3 细胞总RNA提取

2．7．4 总RNA样品质量检测

2．7．5 cDNA链的合成与PCR扩增

2．7．6 扩增产物凝胶图像半定量分析

2．8 统计分析

3 结果

3．1 各受试物对HepG2．2．15细胞的毒性

3．2 受试物对细胞上清液中HBsAg和HBeAg的影响

3．3 DC9对细胞上清液中HBV DNA的影响

3．4 DC9对细胞内HBV DNA的影响

3．5 DC9对HBV P基因mRNA表达水平的影响

4 讨论

4．1 抗HBV体外细胞模型的选择

4．2 抗HBV药物体外筛选中常用的实验方法

4．3 受试物的抗HBV体外机制

5 结论

参考文献

综述 抗乙型肝炎病毒中药研究进展

个人简历

致谢