MYB基因在唾液腺腺样囊性癌发生发展中作用及相关机制的研究

摘要

腺样囊性癌(Adenoid cystic carcinoma，ACC)是唾液腺肿瘤中侵袭性最强的恶性肿瘤之一，约占唾液腺癌的21％-24％，具有嗜神经生长的特性，超过60％的唾液腺腺样囊性癌的患者会复发并伴有远处转移。5年生存率较高，但10年甚至更长时间的生存率偏低，术后极易复发，治疗较棘手。目前，临床上对其没有行之有效的治疗方案。唾液腺腺样囊性癌(SACC，Salivary glands Adenoid cysticcarcinoma)对化疗不敏感，其主要的治疗手段为手术切除联合术后放疗。因为对常规治疗手段的治疗效果并不满意，我们需要进一步了解SACC的生物学行为和分子遗传学特征，试图提供新的见解和治疗策略。随着对腺样囊性癌发生发展的分子机制研究的深入，研究者们发现基因治疗可能是腺样囊性癌治疗的突破点。通过对在肿瘤发生发展中起到调控作用的基因的研究，我们或许能够以调控原癌基因的表达来抑制肿瘤细胞增殖、诱发肿瘤细胞凋亡，最终达到治疗SACC的目的。
　　腺样囊性癌的分子水平下的发病机制是十分复杂的过程，其中染色体6q和9q之间的易位((6;9)(q22-23;p23-24))具有十分重要的作用。Persson等研究者首次报道这种易位能够导致MYB和NFIB基因融合，这种融合具有ACC特异性，占全部ACC发病原因中的86％，使其在分子水平有别于其他肿瘤。MYB-NFIB融合将导致MYB蛋白过表达，及MYB相关靶向基因的表达改变从而导致肿瘤的发生。目前，研究发现约40％人类SACC中都存在MYB-NFIB基因融合，全基因组测序也证实了MYB基因的改变在SACC中普遍存在，同时也在SACC中检测到NOTCH-1改变。NOTCH-1在不同肿瘤组织中作用不尽相同，促瘤和抑瘤作用同时存在，尚无其与MYB在SACC发生发展中之间相互作用的研究。另外，研究发现在不具有MYB-NFIB融合的SACC中也有超过50％具有完整长度MYB基因的过表达，而这种现象并不发生在唾液腺其他肿瘤中。另外，一些研究表明MYB与其下游信号通路的相互作用是导致SACC发生的重要因素。这些研究均提示MYB基因改变可能在SACC的发生发展中起重要作用。由于缺乏有效的研究模型，目前尚无MYB基因改变所引起的MYB过表达在SACC发生发展中作用的相关研究。
　　据此，我们假设MYB过度表达作为原癌基因“启动子”在SACC发生发展中起着重要作用。本实验中我们采用TRE-MYB小鼠和MMTV-tTA小鼠进行杂交建立唾液腺和乳腺特异性过表达MYB的TRE-MYB-M.tTA转基因小鼠模型，进一步研究MYB基因在SACC发生发展中的作用，NOTCH-1是否与其共同影响这一过程。
　　本课题针对以上相关问题分为以下三个部分进行研究:第一部分:建立TRE-MYB转基因，使用TetO-MYB和CMV-rtTA质粒共同转染细胞，通过观察其在多西环素作用下MYB的表达水平来对比小鼠和人类细胞对Tet-On系统的敏感性。在该系统的基础之上进一步建立TRE-MYB转基因小鼠模型。将TRE-MYB小鼠与MMTV.tTA小鼠进行杂交，从其后代中获得同时具有TRE-MYB和 MMTV.tTA基因的 TRE-MYB-M.tTA(+/+)小鼠。在TRE-MYB-M.tTA(+/+)小鼠中收集唾液腺肿瘤，从组织病理学角度对其进行鉴定，并检测其p63和c-KIT的表达水平;第二部分:对TRE-MYB-M.tTA(+/+)小鼠所形成SACC的MYB表达水平进行检测，并观察在多西环素抑制MYB表达后对SACC的影响，从而对MYB在SACC发生发展中作用进行研究;第三部分:对TRE-MYB-M.tTA(+/+)小鼠所形成SACC中NOTCH-1表达水平进行检测，研究其与MYB之间的相关性。初步探索SACC与其他相关肿瘤信号通路和肿瘤标记物的关系。
　　第一部分 TRE-MYB-M.tTA小鼠模型建立及其形成唾液腺腺样囊性癌鉴定
　　目的:
　　建立TRE-MYB-MtTA(+/+)转基因小鼠模型并对所形成SACC进行鉴定
　　方法:
　　使用CMV-rtTA和TetO-MYB质粒对小鼠SCC和人类ACC细胞进行转染，在多西环素的作用下观察对比各细胞MYB的表达水平，确定TRE-MYB转基因表征后进一步建立TRE-MYB转基因小鼠。将获得的TRE-MYB小鼠与获赠于美国内布拉斯加医学中心Dr.Wagner实验室的MMTV.tTA小鼠进行杂交，在其后代中筛选出TRE-MYB-M.tTA(+/+)小鼠并持续喂养。当TRE-MYB-M.tTA(+/+)小鼠SACC成瘤后，收集肿瘤，从组织病理学角度对其进行诊断。同时，在蛋白水平对其p63和c-KIT的表达进行检测。取小鼠正常唾液腺组织作为空白对照。
　　结果:
　　由CMV-rtTA和TetO-MYB质粒共同转染的细胞的MYB的表达能够受到多西环素的调控，并在此基础上成功建立了TRE-MYB转基因小鼠。通过TRE-MYB小鼠与MMTV.tTA小鼠杂交，在其后代成功筛选出TRE-MYB-M.tTA(+/+)小鼠。TRE-MYB-M.tTA(+/+)小鼠中共有9只小鼠成瘤，其中8只为唾液腺肿瘤（其中2只小鼠分别形成2个肿瘤，共10例，留取1只成瘤小鼠进行第二部分实验），1只为乳腺肿瘤，组织病理切片显示9例唾液腺肿瘤均为SACC，1例乳腺肿瘤为乳腺癌。正常唾液腺组织、SACC和乳腺癌中均在蛋白水平不同程度表达p63。空白对照组不表达或者低表达c-KIT，SACC均不同程度过表达c-KIT，乳腺癌不表达c-KIT。
　　结论:
　　成功建立TRE-MYB-M.tTA(+/+)小鼠模型，其唾液腺所形成肿瘤均为SACC。TRE-MYB-M.tTA(+/+)小鼠所形成SACC均不同程度的表达p63和c-KIT。
　　第二部分 TRE-MYB-M.tTA小鼠唾液腺腺样囊性癌中MYB基因的表达
　　目的:
　　研究MYB基因改变导致MYB过表达是否是TRE-MYB-M.tTA(+/+)小鼠形成SACC的原因。
　　方法:
　　取第一部分小鼠肿瘤，分别采用Weatern Blot和免疫组织化学染色对MYB的表达进行检测，已正常唾液腺组织和乳腺癌作为对照。第一部分所留取的荷瘤小鼠采用含有2mg/ml多西环素的RO水持续喂养，测量初始肿瘤体积并每两天测量一次。最后取其肿瘤组织切片进行诊断，采用免疫组织化学染色对MYB表达进行检测。
　　结果:
　　Western Blotting结果显示9例TRE-MYB-M.tTA(+/+)小鼠唾液腺腺样囊癌和1例乳腺癌均过表达MYB。免疫组化结果显示9例SACC均不同程度过表达MYB，乳腺癌中未见表达。多西环素喂养后的小鼠SACC初始肿瘤体积为4767mm3，其体积随天数增加明显缩小，83天后其体积为1368 mm3。其病理组织切片诊断为SACC，免疫组化显示存在MYB过表达但所表达的细胞数较少。
　　结论:
　　MYB基因改变导致MYB过表达可能是引起SACC发生发展的原因之一，抑制其表达能够使肿瘤消退。
　　第三部分 TRE-MYB-M.tTA小鼠唾液腺腺样囊性癌中NOTCH-1表达及其与MYB基因的相关性
　　目的:
　　研究MYB是否与NOTCH-1基因协同作用促进TRE-MYB-M.tTA(+/+)小鼠SACC生成。初步探索SACC与其他相关肿瘤信号通路和肿瘤标记物的关系。
　　方法:
　　取第一部分TRE-MYB-M.tTA(+/+)小鼠所形成唾液腺腺样囊癌组织，分别采用Weatern Blot和免疫组织化学染色对NOTCH-1表达进行检测。采用Real-timePCR在mRNA水平上对Hes1、Hes5、Hey1和Hey2表达水平进行检测。
　　结果:
　　9例TRE-MYB-M.tTA(+/+)小鼠所形成唾液腺腺样囊癌在蛋白水平均不同程度过表达NOTCH-1。在mRNA表达水平，与空白对照组相比较，肿瘤组中Hes5、Hey1和Hey2的表达明显升高，差异具有统计学意义(P＜0.05)。
　　结论:
　　MYB与NOTCH-1基因的协同作用可能是促进SACC形成的原因之一。

目录

声明

摘要

中英文缩略词表

引言

第一部分 TRE-MYB-MtTA小鼠模型建立及对其所形成唾液腺腺样囊性癌的鉴定

1．1 研究背景

1．2 材料与方法

1．3 结果

1．4 讨论

第二部分 TRE-MYB-MtTA小鼠唾液腺腺样囊性癌中MYB基因的表达

2．1 研究背景

2．2 材料与方法

2．3 结果

2．4 讨论

第三部分 TRE-MYB-MtTA小鼠唾液腺腺样囊性癌中NOTCH-1表达及其与MYB基因的相关性及对其他相关信号通路和标记物的初步探索

3．1 研究背景

3．2 材料与方法

3．3 结果

3．4 讨论

全文结论

创新点

参考文献

综述(一)MYB基因及其在肿瘤中的作用

综述(二)腺样囊性癌及其相关作用靶点

个人简历

在学期间发表的论文

致谢