肾小管上皮细胞sEH介导IgA肾病肾间质巨噬细胞浸润及极化的机制研究

摘要

目的：
　　各种慢性肾脏病(chronic kidney disease，CKD)常伴随不同程度的肾脏炎症。疾病早期，炎症发挥保护作用，但持续的炎症状态最终促进肾损伤，进而造成病理上的肾脏纤维化及临床上的终末期肾病(end stage renal disease，ESRD)。在细胞水平，炎细胞的招募及活化是核心。在浸润的多种炎症细胞中，巨噬细胞在调节肾脏炎症及纤维化中发挥重要作用。临床研究提示，CKD患者中，肾脏巨噬细胞浸润越多，预后越差。循环中的单核细胞在炎症信号的驱使下进入肾脏，经历不同途径分化为经典激活的M1型巨噬细胞或选择激活的M2型巨噬细胞。在持续损伤作用下，M1型巨噬细胞促进炎症，最终导致肾脏纤维化;M2型巨噬细胞发挥抗炎作用，最终修复肾脏损伤。
　　环氧二十碳三烯酸(epoxyeicosatrienoic acids，EETs)是花生四烯酸(arachidonic acid，AA)经细胞色素P450(cytochrome P-450，CYP450)的代谢产物，在体内发挥舒张血管、促进血管再生、抗炎、抗氧化、抗血小板聚集及利钠等重要的生理学功能。EETs在可溶性表氧化物水解酶(soluble epoxidehydrolase，sEH)作用下，降解为失活的脱氢二十碳三烯酸(dihydroxyeicosatrienoicacids，DHETs)。因此，sEH是决定EETs生物学活性的关键分子。基因敲除或药理学阻断sEH，增加组织或血浆中EETs水平，可增加其生物学效应。研究提示，无论利用基因手段还是药理学干预sEH，增加EETs，均可发挥降压及抗炎作用，能够在糖尿病肾病、高血压肾病及单侧输尿管结扎(unilateral ureteralobstruction，UUO)肾脏纤维化动物模型中预防纤维化的进展。
　　sEH在肾间质炎细胞浸润的机制及途径尚不清楚。肾小管上皮细胞高表达sEH是否对巨噬细胞浸润及极化发挥作用，尚未见报道。在中国，IgA肾病是CKD最常见的病理类型，除了肾小球病变外，多表现为不同程度的肾小管间质炎细胞浸润。本研究将利用IgA肾病肾穿刺组织，分析sEH表达与临床及病理指标的相关性;通过体外细胞实验观察蛋白尿刺激及调控sEH表达对巨噬细胞极化的影响，探讨肾小管上皮细胞sEH表达与巨噬细胞极化的关系及其机制，为sEH抑制剂治疗肾脏慢性炎症状态及延缓纤维化进展提供干预的新靶点。
　　研究共分两个部分:
　　第一部分:IgA肾病肾小管sEH表达与临床及病理指标的相关性研究
　　利用IgA肾病肾穿刺组织，进行sEH免疫组化染色，分析肾组织sEH表达与临床及病理指标的相关性;探讨肾小管上皮细胞sEH表达与巨噬细胞浸润及炎症因子分泌的相关性，为进一步探讨sEH与巨噬细胞浸润及极化作用提供临床证据。
　　第二部分:肾小管上皮细胞sEH参与巨噬细胞极化的机制研究
　　观察蛋白尿及调控sEH表达对肾小管上皮细胞分泌诱导巨噬细胞极化炎症因子表达的影响;用不同条件干预sEH活性的肾小管上皮细胞培养基孵育巨噬细胞，观察巨噬细胞极化的标志物及细胞转导通路关键蛋白的变化，探讨肾小管上皮细胞sEH参与巨噬细胞极化的作用及可能机制。
　　第一部分 IgA肾病肾小管sEH表达与临床及病理指标的相关性研究
　　方法：
　　收集我院肾内科经肾穿刺诊断为IgA肾病的肾穿刺组织标本、冰冻切片、尿液及临床病理资料共71例。冰冻切片进行sEH免疫组化染色，根据肾小管sEH染色阳性部位面积分为+～++++四组。1.收集临床数据:年龄、性别、平均动脉压、24小时尿蛋白定量及估算的肾小球滤过率(estimating glomerular filtrationrate，eGFR);2.病理学数据:系膜细胞增殖、毛细血管内细胞增生、节段性肾小球硬化、肾小管萎缩/间质纤维化、肾小管间质炎细胞浸润;3.肾组织标本进行Western blot检测sEH蛋白质水平表达;4.利用ELISA试剂盒检测尿液14，15-EET/14，15-DHET评估肾组织sEH活性;5.冰冻切片进行sEH及CD68免疫荧光双染色;6.肾组织标本进行Realtime-PCR检测MCP-1、IL-6、CSF-1、TNF-αmRNA水平表达。
　　结果：
　　1.IgA肾病组肾组织sEH表达及活性明显增加。应用免疫组化染色半定量及Western blot结果提示，与正常对照组相比，IgA肾病组肾小管sEH蛋白质表达明显增加(P＜0.05)。随着sEH在肾小管表达的增加，14，15-EET/14，15-DHET减小，sEH活性增加(P＜0.05)。
　　2.在sEH表达程度不同的IgA肾病组四组间，平均动脉压、蛋白尿、肾间质炎细胞浸润差异具有统计学意义(P＜0.05)。随着sEH表达增加，平均动脉压、蛋白尿及肾间质炎细胞浸润程度逐渐加重。
　　3.肾小管sEH表达与平均动脉压(r=0.408)、蛋白尿(r=0.452)、肾间质炎细胞浸润(r=0.247)呈正相关（均P＜0.05）。
　　4.免疫荧光染色结果提示sEH阳性的肾小管周围存在较多CD68阳性的巨噬细胞。
　　5.Realtime-PCR结果提示sEH低表达IgA肾病组肾组织MCP-1、IL-6、CSF-1及TNF-α mRNA明显高于正常对照组(P＜0.05)，sEH高表达IgA肾病组上述指标明显高于sEH低表达IgA肾病组(P＜0.05)。
　　结论：
　　在IgA肾病肾组织中，肾小管sEH表达及活性明显增加;肾小管sEH表达与平均动脉压、24小时尿蛋白定量及肾间质炎细胞浸润有关;肾小管sEH表达可能促进巨噬细胞极化细胞因子表达，参与巨噬细胞浸润及极化。
　　第二部分 肾小管上皮细胞sEH参与巨噬细胞极化的机制研究
　　方法：
　　以人近端肾小管上皮细胞系(HK-2)及小鼠巨噬细胞系（RAW264.7）为研究对象。应用蛋白尿、sEH抑制剂+蛋白尿、EET+蛋白尿及sEH过表达腺病毒处理HK-2细胞。用上述不同条件处理的HK-2细胞培养基，孵育RAW264.7细胞系，IFN-γ及IL-4作为诱导M1型及M2型巨噬细胞的阳性对照。Western blot检测sEH、p65、p-p65、Akt、p-Akt蛋白表达，Realtime-PCR检测MCP-1、IL-6、CSF-1、TNF-α、iNOS、Arg-1、IL-10 mRNA表达。
　　结果：
　　1.与正常对照组相比，尿蛋白组HK-2细胞sEH蛋白质水平及MCP-1、IL-6、CSF-1、TNF-α mRNA水平表达明显增加（均P＜0.05）。与蛋白尿组相比，sEH抑制剂尿蛋白组上述炎症因子明显减少（均P＜0.05），sEH蛋白质表达无明显变化。
　　2.与蛋白尿组相比，EET尿蛋白组MCP-1、IL-6、CSF-1及TNF-α mRNAshu水平明显减少（均P＜0.05），但sEH蛋白质表达无明显变化。
　　3.与正常对照组及GFP腺病毒组相比，sEH过表达腺病毒组HK-2细胞sEH蛋白质水平及MCP-1、IL-6、CSF-1及TNF-α mRNA水平均明显增加(P＜0.05)。
　　4.与正常对照组HK-2培养基处理的巨噬细胞相比，尿蛋白、sEH过表达腺病毒HK-2培养基处理的巨噬细胞及正常对照HK-2培养基外源性加入IFN-γ组巨噬细胞IL-6、iNOS mRNA表达明显升高(P＜0.05);与蛋白尿组HK-2培养基处理的巨噬细胞相比， sEH抑制剂+蛋白尿组、尿蛋白HK-2培养基外源性加入EET组及正常对照HK-2培养基外源性加入IL-4组巨噬细胞Arg-1、IL-10mRNA水平明显增加(P＜0.05)。
　　5.与正常对照组HK-2培养基处理的巨噬细胞相比，尿蛋白、sEH过表达腺病毒HK-2培养基处理的巨噬细胞及正常对照HK-2培养基外源性加入IFN-γ组巨噬细胞p-p65蛋白表达明显升高（P＜0.05）;与蛋白尿组HK-2培养基处理的巨噬细胞相比，sEH抑制剂+蛋白尿组及尿蛋白HK-2培养基外源性加入EET组明显抑制蛋白尿对p-p65上调，促进p-Akt表达(P＜0.05)。
　　结论：
　　上调肾小管上皮细胞sEH，促进诱导M1型巨噬细胞极化的细胞因子表达;肾小管上皮细胞sEH通过细胞因子及EETs的旁分泌作用，激活NF-κB-p65途径促进巨噬细胞向M1型极化，抑制PI3K-Akt途径抑制M2型巨噬细胞极化。抑制sEH后可逆转上述作用。

目录

声明

摘要

主要符号和缩略语说明

引言

第一部分 IgA肾病肾小管sEH表达与临床及病理指标的相关性研究

1 前言

2 材料和方法

3 结果

4 讨论

5 小结

第二部分 肾小管上皮细胞sEH参与巨噬细胞极化的机制研究

1 前言

2 材料与方法

3 结果

4 讨论

5 小结

6 结论

全文总结

参考文献

综述一 可溶性表氧化物水解酶在肾脏中的作用

综述二 巨噬细胞在肾脏疾病中的作用

个人简历

攻读博士期间发表文章及研究成果

致谢