基于去铁蛋白笼为载体的ROS/pH双响应智能控释系统的构建与研究

摘要

研究目的：为了使药物能在特定的时间特异性的聚集在肿瘤部位，减少对正常组织的损伤，本研究构建了具有自靶向特性ROS/pH双响应的智能控释递药系统（DOX@AFt-RB），并对其理化性质、体内外的靶向性及抗肿瘤活性、体内药物代谢动力学行为等进行了系统研究。考察了该药物递送系统的智能控释效果及去铁蛋白L-链的自靶向性。 研究方法： （1）合成与表征 利用去铁蛋白在不同 pH 条件下可逆性裂解与重组装的特性将抗癌药物阿霉素（DOX）装载于去铁蛋白笼内，通过酰胺键将光敏剂孟加拉红（RB）共价连接于蛋白壳表面。通过紫外（UV-vis）、红外光谱（IR）方法等对该纳米复合物进行结构表征；激光纳米粒度仪测定纳米复合物的粒径及电位；透射电镜（TEM）考察其形貌特征。 （2）智能控释特性研究 DPBF法考察递送系统在体外产生ROS的能力；非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（Native-PAGE）分别考察pH和ROS对蛋白结构的影响；考察了pH和ROS对体外释药行为的影响。 （3）体外抗肿瘤活性及靶向性研究 以4T-1乳腺癌细胞为模型，免疫荧光法考察了SCARA 5受体与AFt特异性结合的特性；采用荧光显微镜及流式细胞仪考察4T-1细胞对该控释系统的摄取及胞内分布情况；SRB法考察该递药系统对4T-1乳腺癌细胞的体外抗肿瘤效果；此外，还考察该控释系统对细胞凋亡结果的影响。 （4）体内药物代谢动力学和体内靶向性研究 以SD大鼠为动物模型，通过HPLC法分别测定化疗药DOX及控释系统DOX@AFt-RB经尾静脉给药后血药浓度随时间的变化，并用PK Solver分析软件进行药动学参数的计算，并绘制药-时曲线；此外，以IR783作为荧光探针，通过小鼠活体荧光成像仪分别观察探针IR783及递药系统IR783@AFt-RB在小鼠体内的组织分布情况。 （5）体内药效学研究 以荷4T-1乳腺癌细胞株的昆明小鼠为动物模型，通过体重、肿瘤体积变化及HE染色病理切片等结果考察该递药系统的抗肿瘤效果及毒副作用。 研究结果：紫外光谱、红外光谱、透射电镜等实验数据表明：DOX被成功地负载于去铁蛋白笼内，光敏剂孟加拉红通过酰胺键连在蛋白壳上。该纳米复合物呈球形结构，具有较小的粒径及良好的分散性。Native-PAGE凝胶电泳结果表明：在酸性或ROS条件下有明显的蛋白碎片产生，且随着pH值的降低或ROS含量的增多蛋白碎片也增多，表明蛋白损伤越严重。体外释药结果也充分表明在酸性条件和ROS存在下的释药率明显高于正常生理条件下或单一响应条件下的释药率。此外，以4T-1乳腺癌细胞为模型，细胞免疫荧光结果表明：该控释体系可通过去铁蛋白轻链受体SCARA 5特异性地靶向至肿瘤细胞。细胞摄取实验结果显示：该递送系统对乳腺癌细胞具有良好靶向性，且在激光照射情况下，DOX可释放更完全并进入细胞核发挥细胞杀伤作用。细胞毒实验结果证明：去铁蛋白作为载体，具有良好的生物相容性。且该控释系统在532 nm激光照射下显示出强大的细胞杀伤作用。细胞凋亡实验结果进一步证明：该递药系统的凋亡率明显高于化疗药DOX，且经激光照射后晚期凋亡率明显升高。此外，本课题对该控释体系进行了一系列体内药效及靶向性评价。大鼠体内药物代谢动力学结果表明：该控释系统药物在大鼠体内的滞留时间高达DOX体内滞留时间的4倍，明显增强抗肿瘤效果。体内活体成像结果表明：该控释系统在肿瘤部位的累积量明显高于其他组织，显示出良好的靶向能力。另外，体内药效学的结果也显示出该制剂有较强的肿瘤抑制作用并且对正常组织器官几乎无毒副作用。 结论：本研究制备的DOX@AFt-RB 药物递送系统依靠 AFt的L-链受体SCARA 5可使载体快速靶向肿瘤部位，并且在532 nm激光照射下，可实现肿瘤靶部位快速释药，高效抑制肿瘤生长。

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