恶性胸腔积液中CCL22分子的机制研究

摘要

背景和目的: 恶性胸腔积液（Malignant pleural effusion，MPE）是晚期恶性肿瘤常见的并发症，并且与肿瘤的发病率和死亡率显著相关。据估计，每年美国约有 15万人，欧洲超过10万人确诊恶性胸腔积液。据文献报道大多数恶性肿瘤都可以引起恶性胸腔积液，其中肺癌、乳腺癌和淋巴瘤是其最常见的原因。虽然细胞学检查是诊断恶性胸腔积液的金标准，但重复胸腔穿刺术对恶性胸腔积液的诊断敏感性通常只有50％-70％。而且，在细胞学阴性的病例中，也只有7％-13％可以通过胸膜活组织检查确诊。恶性胸腔积液通常是癌症晚期的标志，通常预示着患者预后较差，中位生存期从1个月到12个月不等。目前在治疗方法上进展缓慢，仍然以姑息性治疗为主。 肿瘤细胞与肿瘤基质细胞之间的相互作用形成肿瘤特异性微环境，促进了肿瘤的浸润、进展。积聚在肿瘤部位的恶性胸腔积液为研究肿瘤及其微环境和免疫系统之间特异性的相互作用提供了一个独特的机会。虽然关于恶性胸腔积液的研究越来越深入，但关于其发生、发展所涉及的免疫机制仍不是很清楚。白细胞、成纤维细胞和血管内皮细胞一起构成了肿瘤微环境，其中免疫细胞占主要成分。这些免疫细胞与肿瘤细胞相互作用，影响肿瘤的发生、发展和转移。其中，肿瘤相关巨噬细胞（Tumor-associated macrophages，TAMs）是在肿瘤微环境中协调各种因子的比较突出的免疫细胞。而肿瘤微环境中各群免疫细胞之间相互作用促进肿瘤进展的机制目前仍不清楚。本研究主要阐明肿瘤相关巨噬细胞在恶性胸腔积液中的作用及其对其它免疫抑制细胞的影响，为恶性胸腔积液的诊断和治疗提供理论基础。 方法: 收集未经治疗的非小细胞肺癌患者和非肿瘤患者的胸腔积液各40例，采用多因子检测技术筛选出两种胸腔积液差异明显的趋化因子，然后用 ELISA 和实时荧光定量 PCR 验证差异最大的因子；分选出胸水中不同免疫细胞，实时荧光定量 PCR 检测不同免疫细胞 CCL22的表达，应用细胞免疫荧光技术验证巨噬细胞CCL22的表达情况；用PMA、IL-4诱导THP-1细胞向M2型巨噬细胞分化，倒置显微镜观察不同时间段细胞形态改变，用流式细胞术检测诱导之后M2型巨噬细胞表面标志物CD14、CD163的表达，实时荧光定量PCR验证M2型巨噬细胞功能分子的表达情况；采用PCR Array技术分析调控CCL22上调的转录因子C-FOS，ELISA验证用小干扰RNA敲低转录因子C-FOS后CCL22表达情况，荧光素酶报告系统验证转录因子 C-FOS 与 CCL22 启动子区的结合关系，应用染色质共沉淀的方法进一步验证两者之间的结合关系。 结果: 1.多因子检测、实时荧光定量PCR、ELISA结果显示：恶性胸腔积液中CCL22的表达显著高于感染性胸腔积液。 2.实时荧光定量 PCR 结果示：恶性胸腔积液中 CCL22 主要来源于肿瘤相关巨噬细胞。 3.细胞免疫荧光技术同样证实：CCL22主要是来源于肿瘤相关巨噬细胞。 4.PCR Array技术分析表明：C-FOS在CD163+巨噬细胞明显上调。 5.流式细胞术和实时荧光定量PCR结果表明：PMA、IL-4可以诱导THP-1细胞向M2型巨噬细胞分化。 6.ELISA结果显示：小干扰RNA敲低转录因子C-FOS后，巨噬细胞CCL22的表达明显下调。 7.荧光素酶报告系统和染色质共沉淀结果证实：转录因子 C-FOS 可以与CCL22启动子区结合，调控其转录。 结论: 1.恶性胸腔积液中CCL22显著高于感染性胸腔积液且CCL22的表达水平与肺癌患者生存成正相关，可以作为恶性胸腔积液潜在的诊断指标。 2.恶性胸腔积液中CCL22主要来源于肿瘤相关巨噬细胞，恶性胸腔积液中肿瘤相关巨噬细胞CCL22的高表主要是由C-FOS介导的。

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