VEGF预处理对BMMNCs移植治疗慢性脑低灌注大鼠疗效的影响

摘要

慢性脑低灌注（chronic cerebral hypoperfusion，CCH）是血管性痴呆（vascular dementia，VD）和阿尔兹海默病（Alzheimer disease，AD）发生和发展的重要病理过程。随着我国老龄化进程加剧，VD和AD发病率逐年上升，二者共占我国所有痴呆类型的85%以上，已经成为一个重大的医疗和社会问题。寻找与研究以CCH为靶点的有效治疗方法可能对VD和AD的治疗提供新的思路。 骨髓单个核细胞（bone marrow mononuclear cells，BMMNCs）是存在于骨髓中的单个核细胞群，包含多种干（祖）细胞及免疫调节细胞等有效成分。经静脉移植BMMNCs对急性脑梗死的积极疗效已被明确，相关的研究已在国外进入临床Ⅱ期阶段。本人前期就BMMNCs静脉移植对CCH大鼠模型的神经保护作用进行了研究，结果发现BMMNCs移植后亦能迁移至CCH大鼠模型脑部，通过促进血管新生作用显著改善其神经功能预后，为CCH的相关治疗提供了新的可能。 目前BMMNCs移植治疗CCH的效率不高，主要原因为其经静脉移植后向缺血脑部迁移比例过低。血脑屏障（blood brain barrier，BBB）通透性对BMMNCs向颅内迁移至关重要，适度增加BBB通透性可能增加BMMNCs向缺血大脑迁移的比例，进而增加其治疗CCH的疗效。 血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）是脑内广泛表达的神经保护因子。VEGF能够增加BBB通透性，此过程是其促进血管新生必要的功能基础。既往研究提示，适量外源性 VEGF 可能在不影响脑组织结构和功能的前提下“适度”提高 BBB 通透性。本研究拟以 CCH 大鼠模型为研究对象，首先探讨不同剂量的外源性VEGF预处理对CCH大鼠模型BBB的影响，寻找增加 BBB 通透性的最佳 VEGF 干预剂量；然后分析 VEGF 预处理对BMMNCs经静脉移植后在CCH大鼠模型体内定向迁移的影响，明确VEGF预处理能否增加BMMNCs向缺血脑部的迁移，以及是否对BMMNCs外周分布及外周免疫调节作用产生影响；最后以血管新生、神经发生、神经元凋亡及神经功能预后为指标，探讨VEGF预处理能否增加BMMNCs移植治疗CCH大鼠模型的疗效。旨在通过上述研究找到提高BMMNCs移植治疗CHH效率的方法。 第一部分 VEGF预处理对CCH大鼠模型BBB通透性的影响 目的：探讨不同剂量的外源性VEGF预处理对CCH大鼠模型BBB的影响，寻找增加BBB通透性的最佳VEGF干预剂量。 方法：采用经典的双侧颈总动脉结扎术（2-vessel occlusion，2VO）制作CHH大鼠模型。本部分随机将大鼠为三组：假手术组（sham），模型组（2VO）和VEGF预处理组（VEGF）。VEGF组分为5个亚组，分别接受0.4μg/kg，0.6μg/kg，0.8μg/kg，1μg/kg和1.2μg/kg重组大鼠VEGF预处理。VEGF或生理盐水通过侧脑室注射的方法进行干预。以VEGF预处理后6 h作为时间点，通过干-湿重法及水迷宫测试观察各组大鼠脑含水量及神经功能变化，并以此为指标选取不引起脑水肿及神经功能恶化的最大 VEGF 剂量。然后通过检测各组大鼠脑部紧密结合蛋白ZO-1和claudin-5的表达（Western Blot技术）、ZO-1阳性血管数目（免疫荧光技术）及ALB和伊文氏蓝染料泄露情况（免疫荧光技术及分光光度计法），验证该剂量的VEGF对2VO大鼠BBB通透性的影响。 结果：研究结果显示，与0.4μg/kg，0.6μg/kg和0.8μg/kg VEGF组相比，1μg/kg和1.2 μg/kg VEGF预处理组大鼠脑含水量显著增高，神经功能显著恶化，差异有统计学意义（P<0.05）。因此本研究选取0.8μg/kg VEGF作为干预靶剂量，探讨了该剂量下2VO大鼠BBB通透性的变化，结果显示，与vehicle组相比，VEGF （0.8 μg/kg）组大鼠脑部ZO-1和claudin-5蛋白含量显著降低，ZO-1阳性血管数目明显下调，ALB和伊文氏蓝染料泄露明显增加，差异有统计学意义。 结论：0.8μg/kg VEGF预处理能够显著增加2VO大鼠BBB通透性，而不对其脑含水量及神经功能产生不良影响。 第二部分 VEGF预处理对BMMNCs移植后向CCH大鼠模型脑部迁移的影响 目的：探讨VEGF预处理（0.8 μg/kg）对BMMNCs静脉移植后在CCH大鼠模型体内迁移的影响，明确VEGF预处理能否增加BMMNCs向缺血脑部的迁移，以及能否对BMMNCs外周分布（肺脏）及其外周免疫调节功能产生影响。 方法：采用2VO方法制作CCH大鼠模型。采用梯度离心法从eGFP转基因SD大鼠或普通SD大鼠股骨和髂骨中提取BMMNCs，以1.2×107 BMMNCs/kg的剂量，通过尾静脉注射进行移植。本部分随机将大鼠为 6 组：假手术+溶剂组（sham+vehicle ），假手术+细胞移植组（sham+BMMNC ），模型+溶剂组（2VO+vehicle），模型+细胞移植组（2VO+BMMNC），模型+VEGF预处理（0.8μg/kg）+细胞移植组（2VO+VEGF+BMMNC）和模型+SU5416预处理（4nM）+细胞移植组（2VO+SU5416+BMMNC）。各组大鼠均接受侧脑室注射（生理盐水、VEGF或SU5416）以及尾静脉注射（DMEM或BMMNCs单细胞悬液）操作。通过免疫荧光检测，观察细胞移植后6h各组大鼠大脑及肺脏e-GFP+BMMNCs的数量，并通过ELISA技术，观察各组大鼠外周血IL-10、L-1β和TNF-α的表达情况。 结果：研究结果显示，VEGF预处理（0.8μg/kg）显著增加了BMMNCs移植后向2VO大鼠缺血脑部的迁移数量，而VEGF受体阻断剂SU5416则显著降低了这一趋势。VEGF或SU5416预处理并不影响BMMNCs移植后向肺脏的定向迁移，也不影响BMMNCs移植引起的外周血IL-10、L-1β和TNF-α等免疫因子变化。 结论：0.8μg/kg VEGF预处理能够显著增加BMMNCs移植后向缺血脑部的迁移量，而对BMMNCs向肺部的迁移以及外周免疫（IL-10、L-1β和TNF-α）没有影响。 第三部分 VEGF预处理对BMMNCs移植治疗CCH大鼠模型疗效的影响 目的：以血管新生、神经发生、神经元凋亡及神经功能预后为指标，探讨VEGF预处理（0.8μg/kg）对BMMNCs移植治疗CCH大鼠模型疗效的影响。 方法：采用2VO方法制作CCH大鼠模型。采用梯度离心法从SD大鼠股骨和髂骨中提取BMMNCs，以1.2×107 BMMNCs/kg的剂量，通过尾静脉注射进行移植。本部分将大鼠随机为 6 组：假手术+溶剂组（sham+vehicle），假手术+细胞移植组（sham+BMMNC ），模型+溶剂组（2VO+vehicle ），模型+细胞移植组（2VO+BMMNC ），模型+VEGF 预处理（0.8 μg/kg ）+细胞移植组（2VO+VEGF+BMMNC ）和模型+SU5416 预处理（4-nM ）+细胞移植组（2VO+SU5416+BMMNC）。各组大鼠均接受侧脑室注射（生理盐水、VEGF或SU5416）以及尾静脉注射（DMEM或BMMNCs单细胞悬液）操作。通过水迷宫测试，评价各组大鼠神经功能变化情况；通过免疫荧光检测，观察各组大鼠脑部血管新生（Ki67阳性血管数量）、神经发生（SVZ区增殖细胞数量）以及神经元凋亡（FJB阳性细胞数量）的影响，综合探讨VEGF预处理对BMMNCs治疗CCH大鼠疗效的影响。 结果：研究结果显示，VEGF预处理显著上调了BMMNCs移植介导的神经功能改善作用；与 2VO+BMMNC 组相比，2VO+VEGF+BMMNC 组大鼠脑部BrdU+/Lectin+血管数量、SVZ区增殖细胞数量显著增加，FJB+细胞数量显著减少，差异有统计学意义；SU5416预处理则显著削弱了BMMNCs移植介导的神经保护作用。 结论：VEGF预处理（0.8μg/kg）能显著增加BMMNCs移植治疗CCH大鼠模型的疗效。

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