骨髓间充质干细胞来源的外泌体对大鼠脊髓损伤后运动功能恢复和星形胶质细胞活化的影响

摘要

背景与目的 脊髓损伤（Spinal Cord Injury，SCI）是发生于中枢神经系统的严重致残性疾病，多由交通伤、战伤等意外伤害导致。脊髓损伤后引起损伤节段以下肢体严重的功能障碍、膀胱排尿功能障碍、神经病理痛、括约肌及自主神经功能障碍等。我国SCI的发病率相对较高，达到23.7-60.6/1000000[1，2]，SCI常发病突然且终身残疾率高，对患者和其家庭的生活产生长期而持续的负面影响，也给社会带来了巨大负担。 星形胶质细胞是一种广泛存在于中枢神经系统的支持细胞，生理状态下具有支持和引导神经元迁移、维持突触生理功能，构成血脑屏障及协助神经元代谢等功能。脊髓损伤后，静息状态的星形胶质细胞过度活化，分泌神经抑制因子和细胞外基质，如胶质纤维酸性蛋白（GFAP）、胶原蛋白等，导致神经细胞的凋亡、炎症[3] 。因此，SCI 后如何抑制星形胶质细胞的过度活化，减少神经元的死亡，在SCI修复中具有十分重要的意义。 间充质干细胞（Mesenchymal Stem Cells，MSCs）是一类具有多向分化潜能的多能干细胞，是对脊髓损伤的细胞移植治疗中最常应用的细胞类型之一。MSCs分泌多种神经保护性营养因子，对星形胶质细胞活化也具有较强的多靶点调控作用。MSC来源的外泌体（exosomes）是由MSCs主动分泌的大小均一，直径约40~100nm的膜性囊泡小体。其内含有多种蛋白质、RNA、DNA等，在不同细胞间进行信息传递。MSCs 外泌体不仅能模拟 MSCs 多数的生物学功能，促进组织修复和治疗疾病，且在很多方面比MSCs更有优势，因此具有广阔的临床应用前景。 本研究提取大鼠骨髓间充质干细胞（Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells，BMSCs）来源的外泌体，通过尾静脉注射将外泌体应用于实验性 SCI的大鼠，检测损伤后特定时间点其后肢运动功能恢复情况、损伤处活化星形胶质细胞和残余神经元数量，初步探索BMSCs来源的外泌体对脊髓损伤后大鼠运动功能恢复、星形胶质细胞活化的影响。 材料与方法 全骨髓培养法培养 BMSCs并用流式细胞术鉴定其表面标志CD90和CD34。收集BMSCs上清液，超速离心法提取并用PKH26染液标记外泌体，透射电镜观察其微观结构，Western blot法检测其表面标志物CD63、CD9的表达水平。将外泌体通过尾静脉注射的方法应用于SCI大鼠，于SCI后各时间点进行后肢运动功能（basso,beattie and bresnahan，BBB）评价，并于预定时间点处死大鼠、取损伤脊髓段约1.5 cm，免疫荧光法检测星形胶质细胞活化数量和残余神经元数量。 结果 1. 培养的骨髓间充质干细胞阳性表达CD90，阴性表达CD34。 2.提取的外泌体在电镜下呈茶托状外形，直径约40~100nm，Western blot法检测其阳性表达 CD63和CD9。 3. 术后14d、28d治疗组神经功能有一定程度改善，与损伤组间差异有统计学意义（p<0.05）。 4. 术后7d、14d、28d治疗组反应性星形胶质细胞数量较损伤组明显降低，差异具有统计学意义（p<0.05）。 5. 术后7d、14d、28d治疗组残余神经元数量高于相应时间点损伤组，差异具有统计学意义（p<0.05）。 结论 BMSCs分泌的外泌体可减少脊髓损伤区域活化星形胶质细胞的数量，减少神经元的死亡，有利于脊髓损伤后后肢运动功能的改善。

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