负性共刺激因子PD-1、PD-L1和TIM-3在口腔鳞癌中的表达及临床意义

摘要

口腔鳞状细胞癌(oral squamous cell carcinoma，OSCC)是在口腔恶性肿瘤中最常见的一种疾病，其发病原因尚未完全探究清楚。许多研究证实肿瘤的发生发展与机体免疫系统密切相关。在肿瘤微环境中T细胞功能障碍在肿瘤免疫逃逸中起到重要作用，免疫检查点分子的异常表达导致的T细胞功能障碍是目前的研究热点。程序性死亡分子-1(Programmed death-1，PD-1)及其配体程序性死亡分子配体-1(Programmed death receptor ligand-1，PD-L1)和T细胞免疫球蛋白粘蛋白分子-3(T cell immunoglobulin and mucin domain3，Tim-3)是影响T细胞功能的重要免疫调节因子。在肿瘤微环境中，PD-1与其配体PD-L1结合，通过SHP2/PI3K/Akt通路、SKP2/P15/P27通路、Zap70/PKC/NF-κB通路等几种途径，使得T细胞的活性及功能受到抑制，抑制T细胞的增殖，并加速T细胞的凋亡，使T细胞无能;TIM-3与其配体半乳凝素-9等蛋白结合，通过激活STAT3通路、PI3K/Akt/mTOR通路，抑制Akt/NF-κB信号通路等方法，达到与PD-1/PD-L1协同的作用，造成肿瘤细胞的免疫逃逸。以往研究发现PD-1和TIM-3在乳腺癌、肝癌等多种恶性肿瘤中均存在表达异常，且其表达水平与肿瘤的发生发展有着密切的联系，在结肠癌、肝癌等实体瘤中存在PD-1和TIM-3的共表达现象，与患者的病情严重程度密切相关。然而在OSCC领域PD-1、TIM-3的相关研究较少。因此，本文从PD-1、PD-L1和TIM-3出发，进一步研究其在OSCC发生发展过程中的表达和作用机制。
　　目的：
　　通过检测在OSCC肿瘤组织和正常口腔黏膜组织中PD-1、PD-L1和TIM-3在蛋白以及mRNA水平上的表达情况，讨论PD-1、PD-L1和TIM-3在OSCC发生发展过程中所起作用及其临床意义，为进一步了解OSCC的发生发展过程及机制，以及为OSCC患者的免疫靶向治疗提供前期理论依据。
　　方法：
　　研究标本是取自从2016年1月到2017年10月在河南肿瘤医院病理科存档的经手术切除和组织病理学诊断的蜡块。其中诊断为OSCC的42例蜡块为实验组，诊断为正常口腔黏膜的22例蜡块作为对照组。通过免疫组化技术和实时荧光定量逆转录多聚酶链反应技术，检测实验组和对照组石蜡组织中PD-1、PD-L1、TIM-3蛋白和mRNA的表达，并分析目标蛋白与OSCC患者临床病理参数之间的关系。实验所得各组数据均使用SPSS21.0软件对其进行统计学分析，定性资料的组间差异性比较使用x2检验或Fisher确切概率法，采用t检验进行定量资料的组间比较，应用Spearman相关分析方法进行目标蛋白或mRNA的相关性分析。取检验水准α=0.05，P＜0.05代表差异具有统计学意义。
　　结果：
　　1.PD-1、PD-L1、TIM-3蛋白的表达情况在实验组与对照组存在显著差异。PD-1蛋白在OSCC组和正常口腔黏膜组阳性表达率分别为61.9％和22.7％，PD-L1蛋白在OSCC组和正常口腔黏膜组阳性表达率分别为66.7％和4.5％，TIM-3蛋白在OSCC组和正常口腔黏膜组阳性表达率分别为64.3％和18.1％，差异均具有统计学意义(P＜0.05)。
　　2.PD-1、PD-L1、TIM-3mRNA的表达情况在实验组与对照组存在显著差异。PD-1mRNA在OSCC组和正常口腔黏膜组的相对表达量分别为0.257±0.253和0.002±0.000，PD-L1mRNA在OSCC组和正常口腔黏膜组的相对表达量分别为6.736±263.384和0.404±1.057，TIM-3mRNA在OSCC组和正常口腔黏膜组的相对表达量分别为13.041±2597.003和0.067±0.014，差异均具有显著性统计学意义(P＜0.05)。
　　3.PD-1和PD-L1蛋白的表达水平与患者临床病理参数相关。PD-1蛋白在TNM分期为Ⅰ+Ⅱ期和Ⅲ+Ⅳ期的阳性率分别为60.0％和94.1％，其差异具有统计学意义(x2=6.093，P=0.014);PD-L1蛋白在肿瘤大小≤5.4cm和＞5.4cm的患者中的阳性表达率分别为58.1％和90.9％，其差异具有统计学意义(x2=3.941，P=0.047)。TIM-3蛋白的表达与患者临床病理特征无明显相关，其差异均无统计学意义(P＞0.05)。
　　4.PD-1和TIM-3的表达存在相关性。Spearman相关分析发现，OSCC组织中PD-1与TIM-3mRNA间呈正相关关系(rs=0.941，P=0.005＜0.05)。PD-1与PD-L1蛋白、PD-1与Tim-3蛋白、PD-L1与TIM-3蛋白之间无明显相关性(P＞0.05);PD-1与PD-L1mRNA、PD-L1与TIM-3mRNA之间无明显相关性(P＞0.05)。
　　结论：
　　1.在OSCC肿瘤组织中负性共刺激因子PD-1、PD-L1和TIM-3的表达水平均比正常口腔黏膜组织中高，提示在OSCC病损局部T细胞功能处于抑制状态，OSCC微环境呈现免疫抑制的状态。
　　2.PD-1的表达水平与OSCC患者的TNM分期相关，PD-L1的表达水平与OSCC患者的肿瘤大小相关，而Tim-3的表达水平与OSCC患者临床病例参数均无明显相关，提示PD-1/PD-L1的表达水平同患者临床OSCC的病情轻重及预后有关。
　　3.在OSCC组织中，PD-1和TIM-3mRNA的表达水平呈正相关，提示PD-1、TIM-3在OSCC组织中的呈现协同作用，PD-1和TIM-3可能存在共表达。
　　4.PD-1、PD-L1和TIM-3可能为OSCC的生物学标记物，是OSCC的免疫治疗靶点。

目录

声明

摘要

图和附表清单

缩略词中英文对照表

1 前言

2 材料与方法

2．1 研究标本

2．2 伦理学说明

2．3 主要仪器设备和试剂

2．4 免疫组织化学法检测石蜡组织中PD-1／PD-L1和TIM-3蛋白表达

2．5 实时荧光定量逆转录多聚酶链反应方法检测石蜡组织中PD-1／PD-L1和TIM-3 mRNA表达

2．6 统计学分析

3 实验结果

3．1 OSCC患者临床病理资料

3．2 OSCC及正常口腔黏膜组织的qRT-PCR检查结果

3．3 OSCC及正常口腔黏膜组织的免疫组织化学检查结果

3．4 OSCC组织中PD-1、PD-L1和TIM-3蛋白的表达水平与患者临床病理参数的关系

3．5 PD-1／PD-L1与TIM-3蛋白及mRNA在OSCC组织中表达的相关性分析

4 讨论

4．1 肿瘤微环境中的免疫抑制现象

4．2 PD-1／PD-L1和TIM-3在OSCC及正常口腔黏膜组织中的表达情况的分析

4．3 PD-1、PD-L1和TIM-3的表达与OSCC患者临床病理参数的关系的分析

4．4 在OSCC中PD-1、PD-L1和TIM-3的表达相关性分析

4．5 对本实验的总结及展望

5 结论

参考文献

综述

个人简历、在校发表学术论文及研究成果

致谢