血管紧张素Ⅱ诱导的ChemR23在足细胞损伤中的作用及机制

摘要

肾小球足细胞是构成肾小球滤过系统的细胞组成成分之一，位于滤过膜的最外层，足细胞的结构和功能对于维持肾脏正常功能具有重要的作用。足细胞损伤是蛋白尿产生、肾小球硬化及糖尿病肾病（diabeticnephropathy,DN）的重要原因。系统性或肾脏局部的肾素-血管紧张素-醛固酮系统（renin-angiotensin-aldosterone system,RAAS）在很多肾脏疾病的发生发展中占有重要位置。血管紧张素Ⅱ（angiotensinⅡ,AngⅡ）是RAAS系统中活性很高的效应分子，而且在肾单位中AngⅡ的合成不依赖于血液循环中的肾素、血管紧张素转化酶(angiotensin converting enzyme,ACE)和AngⅡ浓度，而是形成一个独立的合成系统，且浓度高于外周循环中AngⅡ的浓度的80-100倍，这可能说明AngⅡ对肾脏的直接生物学效应更大。研究发现足细胞AngⅡ作用浓度升高可造成足细胞结构变化及功能损伤。ChemR23，也称为CMKLR1，是一种七次跨膜G蛋白偶联受体，在多种细胞的细胞膜及细胞质中表达，主要介导由炎症反应介导的疾病，如系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus,SLE）和DN，但是介导机制不详。 目的： 1.观察AngⅡ刺激下小鼠足细胞ChemR23、Nephrin、Podocin的表达变化。 2.通过沉默ChemR23的表达，观察Nephrin、Podocin表达变化及对信号通路相关蛋白NF-κB P65磷酸化的影响。 3.通过抑制NF-κB P65的磷酸化，观察足细胞损伤蛋白Nephrin、Podocin表达变化。 方法： 条件永生化小鼠足细胞系使用含10U/mL的γ-干扰素、5.6mmol/L葡萄糖、1%双抗、10%FBS的RPMI-1640培养基培养于33℃。将33℃条件下培养的足细胞用10%FBS、5.6mmol/L葡萄糖、1%双抗的RPMI-1640培养基培养于37℃、含5%的CO2环境中诱导分化，2周后分化成熟即可用于相关实验。（1）分为三组：正常对照组，低浓度AngⅡ组（AngⅡ：1×10-7mol/L），高浓度AngⅡ组（AngⅡ：1×10-6mol/L）分别刺激足细胞24小时，qRT-PCR法及Western Blot印迹法分别检测三组的ChemR23、Nephrin及Podocin的表达；（2）使用慢病毒干扰足细胞ChemR23表达后，Western Blot印迹法检测Nephrin和Podocin表达变化以及对NF-κB P65蛋白磷酸化水平的影响；（3）使用NF-κB P65抑制剂预孵育细胞2h，Western印迹法观察对Nephrin及Podocin表达的影响。 结果： 1、与正常对照组相比，AngⅡ刺激足细胞可在显著增加足细胞ChemR23的表达，同时减少Nephrin及Podocin表达（P＜0.05），且其效应具有浓度依赖性。 2、使用慢病毒干扰ChemR23表达后，与AngⅡ刺激组相比，AngⅡ+shRNA干扰ChemR23组Nephrin及Podocin表达明显恢复（P＜0.05）；Western Blot印迹结果显示，AngⅡ刺激可导致NF-κB p65磷酸化水平明显升高（P＜0.05），而干扰ChemR23表达可抑制其磷酸化水平。 3、加入NF-κB p65抑制剂后，AngⅡ诱导的Nephrin及Podocin表达降低得到恢复（P＜0.05）。 结论： 1.AngⅡ刺激后ChemR23表达升高，足细胞Nephrin，Podocin表达降低，且均有AngⅡ浓度依赖性。 2.干预ChemR23的表达可明显抑制AngⅡ诱导的足细胞损伤。 3.抑制NF-κB p65的磷酸化可逆转AngⅡ导致的足细胞损伤。

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