基于分子对接技术HSP27与β受体激动剂结合能力的探索

摘要

目的: β肾上腺素受体激动剂（简称β受体激动剂）在食品中的非法添加一直是影响中国居民健康的热点问题之一，尤其多种 β 受体激动剂的混合使用以及新型结构类似物的出现，引起居民对食品安全问题的恐慌，并且增加了市场监管的难度。因此，β受体激动剂多残留快速检测技术成为社会发展的新需求。该研究主要利用分子对接技术将人工表达的β2肾上腺素受体（β2adrenergic receptor,β2AR）和热休克蛋白27（heat shock protein 27，HSP27）与β受体激动剂分别进行分子对接，比较他们结合能力的差异性，探索HSP27用于β受体激动剂多残留检测的可能性。 方法: 1. 将HSP27和β2AR分别与β受体激动剂类小分子药物进行分子对接，比较它们与β受体激动剂类小分子药物结合能力的差异性。 2. 将β2AR基因转入大肠杆菌BL21，表达出具有功能活性的β2AR蛋白，对诱导表达条件进行优化，并对表达的β2AR蛋白进行纯化。 3. 将HSP27基因转入大肠杆菌BL21，表达出具有功能活性的HSP27蛋白，对诱导表达条件进行优化，并对表达的HSP27蛋白进行纯化。 4. ELISA方法对β2AR和HSP27与β受体激动剂类小分子药物结合能力进行验证。 5. 将HSP27用于检测3种β受体激动剂类小分子药物，建立标准曲线，计算检出限值，探索HSP27用于β受体激动剂多残留检测方面的可能性。 结果: 1. 分子对接结果 克伦特罗、莱克多巴胺和非诺特罗三种β受体激动剂分别与HSP27和β2AR的对接模型图显示：在其形成的“配基结合小袋”中，HSP27和β2AR与β受体激动剂类小分子药物依靠疏水键和氢键相互作用。15组对接结果中9组HSP27的分子对接总评分值高于β2AR。配对t检验分析它们结合能力的差异性具有统计学意义（P=0.03）。 2. β2AR蛋白的表达与纯化结果 重组β2AR基因在大肠杆菌BL21中成功表达出β2AR蛋白，蛋白大小为47 KD 左右，诱导表达条件：在细菌生长对数期（OD=0.6～0.9）加入浓度为 1.0 mmol/L的IPTG，37℃，220 r/min，振荡培养16 h。经超声破碎、离心后留取上清，在浓度为300 mmol/L咪唑洗脱液下纯化出蛋白。 3. HSP27蛋白的表达与纯化结果 HSP27基因在大肠杆菌BL21中成功表达出HSP27蛋白，蛋白大小为27 KD左右，诱导表达条件：在细菌生长对数期（OD=0.6～0.9）加入浓度为0.8 mmol/L的IPTG，37℃，220 r/min，振荡培养16h。经超声破碎、离心后留取上清，在浓度为250 mmol/L咪唑洗脱液下纯化出蛋白。 4. ELISA活性鉴定结果 ELISA方法进行其活性鉴定，结果表明：HSP27蛋白和β2AR蛋白与克伦特罗、莱克多巴胺和非诺特罗三种 β 受体激动剂的酶标记物均能够发生特异性反应，HSP27的OD值分别为0.685，0.662和0.525。β2AR的OD值分别为0.448、0.320和0.362。 5．HSP27在β受体激动剂检测方面的应用 HSP27用于3种β受体激动剂类药物检测的结果显示，在1μg/L~1000μg/L范围内，HSP27与3种β受体激动剂具有较好的线性关系，莱克多巴胺和非诺特罗与克伦特罗交叉反应率分别为52.6%和29.7%，检出限值为1.53μg/L。克伦特罗、莱克多巴胺和非诺特罗的添加回收率范围分别为 52.7%~77.3%，51.7%~71.3%和52%~76.8%，重复试验中变异系数均小于15%，表明HSP27在3种β受体激动剂类药物检测中具有较好的重复性。 结论: 通过分子对接技术，本研究发现HSP27与β受体激动剂具有较强的结合能力，并发现HSP27在β受体激动剂的多残留检测方面的作用，为β受体激动剂的多残留检测技术的建立提供新的思路和理论依据。

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