褪黑素延缓排卵后卵子老化、改善胚胎质量机制研究

摘要

处于减数分裂前期I的初级卵母细胞在排卵时恢复第一次减数分裂，伴随着生发泡破裂和第一极体的排出，而后阻滞在第二次减数分裂中期（MII）等待受精。一般大约有10小时的最佳受精时间，如果未在最佳时间窗内受精，卵子质量会逐步退化，这一过程即“卵子老化”。表现为卵母细胞形态异常改变，透明带硬化，纺锤体异常，染色体非整倍体增多等，进而影响卵子质量和早期胚胎发育进程。随着辅助生殖技术的广泛普及，行体外受精-胚胎移植技术助孕的患者越来越多，取卵后卵子体外老化（post-ovulatory oocyte aging）问题是辅助生殖技术过程中不可避免的一个不利因素。近年越来越多的证据表明卵子老化是由ROS(reactiveoxygenspecies)与Sirtuins家族(silentinformation regulator family)蛋白相互调节的过程。 褪黑素(Melatonin)主要是由人类的松果体产生的一种胺类激素，其分泌具有昼夜节律，目前关于褪黑素的研究主要集中于其较强的抗氧化特性和自由基清除能力。多系统研究证实褪黑素可以有效降低ROS的产生，然而在卵子体外老化过程中，褪黑素是否可以通过调控Sirtuins家族蛋白的表达延缓卵子老化及其具体调控机制尚未见研究报道。 目的： 研究褪黑素延缓排卵后卵子老化、改善胚胎质量的调控机制，检验其临床治疗的有效性及相关机理，为其应用到临床提供可靠的理论依据。 方法： 6周龄ICR雌鼠，PMSG(pregnant mare serum gonadotropin)腹腔注射（7.5IU/只）+48小时后hCG(human Chorionic Gonadotropin)（7.5IU/只）联合应用进行超排卵，获取MII期卵母细胞后分别体外培养0h，6h，12h，24h获取体外老化的MII期卵母细胞，并在24h组培养液中加入不同浓度褪黑素(10?7M,10?5M和10?3M)共同孵育.显微镜下观察卵子形态和胚胎发育情况，采用免疫荧光染色技术检测卵母细胞内ROS水平，线粒体形态及纺锤体形成。RT–PCR技术检测相关基因mRNA的表达，应用Western blot和免疫荧光染色技术对Sirtuins家族相关蛋白及其下游因子的蛋白表达进行验证。同时分别添加SIRT1的激活剂和抑制剂进一步验证褪黑素在卵子体内老化过程中对SIRT1及MnSOD的调控作用。 结果： 1.排卵后体外老化卵子形态异常比例随时间延长而增加（P＜0.001），褪黑素可以显著改善体外老化过程中卵子形态异常，并呈剂量依赖效应（P＜0.01）。 2.褪黑素可以显著降低体外老化过程中卵母细胞的ROS含量（P＜0.001）及纺锤体异常（P＜0.001）。 3.褪黑素可以显著增加体外老化卵子的线粒体膜通透性（P＜0.001），减少线粒体异常分布（P＜0.001）。 4.排卵后卵子体外老化过程中自噬水平增加，凋亡增多，褪黑素应用可以显著降低自噬（P＜0.001），减少凋亡（P＜0.001）。 5.褪黑素应用可显著增加老化卵子受精后发育至4细胞（P＜0.01）和囊胚（P＜0.01）的比例，改善早期胚胎发育。 6.褪黑素可以显著上调SIRT1及MnSOD的mRNA及蛋白表达水平（P＜0.01）。 7.已加入褪黑素的培养液中同时添加SIRT1的抑制剂后，卵母细胞ROS产生显著增加（P＜0.001），纺锤体异常比例增多（P＜0.001）。 8.卵母细胞体外培养24h过程中加入SIRT1的激活剂，其ROS产生显著下降（P＜0.001），纺锤体异常比例显著减少（P＜0.001）。 结论： 褪黑素通过SIRT1-MnSOD依赖的通路显著减少排卵后体外老化卵子ROS产生，减少异常减数分裂，改善线粒体功能，降低卵母细胞自噬和凋亡水平，进而改善卵子质量及早期胚胎发育，可作为辅助生殖技术过程中改善排卵后卵子老化的有效治疗药物。

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