胱抑素C单克隆抗体的制备及荧光免疫层析法的建立

摘要

目的：为更好的评价早期肾损伤，选取临床上常用的灵敏度好的胱抑素 C作为检测指标。通过基因重组技术构建、表达人胱抑素 C 蛋白，利用杂交瘤技术制备胱抑素C单克隆抗体，建立胱抑素C荧光免疫层析检测方法，为临床早期肾损伤快速检测提供一种新方法。 方法：1.重组质粒构建：根据Gen Bank人胱抑素C（NM 000099.3）序列合成目的基因并设计亚克隆引物，PCR扩增后与PET-28a进行双酶切、连接，转化入BL21（DE3）感受态细胞，制备BL21（DE3）-pET28 a-CysC重组菌，并采用双酶切及基因测序鉴定。 2.蛋白表达、纯化：诱导重组菌表达胱抑素 C 蛋白，优化诱导剂 IPTG 作用浓度及诱导时间，采用Ni+亲和层析法纯化表达产物，并将纯化获取的胱抑素C重组蛋白透析复性，ELISA鉴定重组蛋白的抗原活性。 3.单抗制备：用上述胱抑素C蛋白免疫小鼠，选用免疫效果最佳的小鼠脾脏细胞和骨髓瘤细胞融合制备杂交瘤细胞，筛选出稳定分泌特异性抗体的单克隆细胞株，注入小鼠腹腔，制备单克隆抗体，用正辛酸-硫酸铵沉淀法纯化腹水，并对纯化后的单克隆抗体进行效价、纯度、亚型鉴定。 4.检测方法建立：通过制备室内参考品、筛选最适于荧光免疫层析检测方法的胱抑素 C 配对抗体，研究确定最佳试纸条制备工艺及相应组份，对其线性、最低检出限、精密性、准确性、稳定性等功能进行检测，初步建立胱抑素 C 荧光免疫层析检测方法。 结果：1.构建成功BL21（DE3）-pET28a-Cys C重组菌，最优表达条件为37℃、0.2 mmol/LIPTG诱导6h，目的蛋白为包涵体，经8 mol/L尿素溶解、亲和层析纯化、透析复性，ELISA测定胱抑素C抗原反应效价在104以上。 2.筛选出5株针对IgG1亚型的胱抑素C单克隆细胞、制备5株单克隆抗体，效价检测在1.28×105-1.024×106，SDS-PAGE检测所得抗体纯度均大于95 %。 3.以3H4为包被抗体、1A7为标记抗体建立胱抑素C荧光免疫层析检测方法，制备出检测时间 5min，线性范围为 0.05mg/L-20mg/L、R2大于 0.99，精密性好、稳定性强、准确度高的快速诊断试纸条。 结论：利用基因工程方法制备出具有生物活性的胱抑素 C 蛋白；用杂交瘤技术获得5株胱抑素C单抗；初步建立了胱抑素C荧光免疫层析检测方法。

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