NADPH氧化酶4在A549细胞上皮-间质转化中的作用

摘要

背景与目的: 肺癌是严重影响人类健康的恶性肿瘤，造成肺癌病人死亡的主要原因之一是肺癌的转移。上皮-间质转化（Epithelial-mesenchymal transition，EMT）进程是肺癌转移的重要机制之一，同时是促进肿瘤转移的重要步骤。因此探索细胞的EMT 进程机制，将会为肺癌转移的治疗提供理论依据。转化生长因子-β（Transforming growth factor-β，TGF-β）是一类多功能细胞因子，是体外细胞EMT模型的经典诱导因子。NADPH氧化酶4（Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate4，NADPH4）是NOX家族里面的一个重要类型，其主要作用是产生活性氧（Reactive oxygen species，ROS）。ROS可以作为第二信使促进细胞内一些信号通路的转导，进而调控细胞的增殖、凋亡、分化以及迁移等生物学行为。在乳腺癌细胞中，丝裂原活化蛋白激酶（Mitogen-activated protein kinase，MAPK）信号通路介导了TGF-β诱导的细胞EMT进程。在人恶性胶质细胞瘤细胞中，TGF-β可以激活核转录因子-κB（Nuclear factor-κB，NF-κB）信号通路，进而促进EMT进程。在前期实验中，TGF-β诱导A549细胞EMT进程时，伴随着NOX4蛋白以及ROS水平的增加，并且促进细胞的迁移。那么，MAPK、NF-κB信号通路是否介导TGF-β诱导的A549细胞EMT进程？MAPK、NF-κB(p65)与NOX4在 A549 细胞 EMT 进程中有着怎样的关系？为了探索以上问题，本课题用TGF-β 刺激 A549 细胞以构建 EMT 模型，然后分别用 DPI、SB203580、BAY11-7082抑制NOX4、p38MAPK以及NF-κB(p65)，观察对A549细胞EMT进程以及细胞增殖活性和迁移能力的影响。 方法: 1、实验分组：（1）EMT模型的构建：根据TGF-β质量浓度分为：0.0μg/L组、1.0μg/L组、2.5μg/L组、5.0μg/L组、10.0μg/L组；（2）抑制NOX4表达时分为：空白组，TGF-β组，TGF-β+DPI组，DPI（NOX4抑制剂）组，DMSO （溶剂对照）组；（3 ）抑制 p38MAPK 表达时分为：空白组，TGF-β 组，TGF-β+SB203580组，SB203580（p38MAPK抑制剂）组，DMSO（溶剂对照）组；（4）抑制NF-κB(p65)表达时分为：空白组，TGF-β组，TGF-β+BAY11-7082 组，BAY11-7082（NF-κB(p65)抑制剂）组，DMSO（溶剂对照）组。 2、蛋白的检测：Western Blot检测NOX4蛋白、EMT相关蛋白E-cadherin、Vimentin、Snail蛋白，信号通路蛋白p38MAPK、p-p38MAPK、JNK、p-JNK、NF-κB (p65)、p-NF-κB (p-p65)蛋白的表达。 3、mRNA水平检测：Real-Time PCR检测NOX4 mRNA、p38MAPK mRNA、NF-κB(p65) mRNA的水平。 4、ROS的检测：激光共聚焦显微镜定性观察ROS水平，流式细胞仪定量检测ROS的水平。 5、细胞形态的观察：使用活细胞工作站对细胞进行拍照，观察其细胞形态的变化。 6、迁移能力的检测：划痕实验检测细胞迁移能力，用photoshop软件对细胞划痕宽度进行分析，根据划痕宽度判断细胞迁移能力的改变。 7、细胞增殖活性的检测：MTT 细胞增殖活性检测试剂盒联合酶标仪检测细胞的增殖活性，根据不同组别吸光度的不同判断细胞的增殖活性。 8、统计学分析：实验所得原始数据采取均数加减标准差表示（?x±s），数据采用SPSS 21.0软件进行统计分析。5组分组的均数比较采取单因素方差分析（one-way ANOVA），各组数据的均数之间两两比较采用最小显著差法（LSD-t检验）；2组分组的均数比较采取两独立样本t检验。检验水准α=0.05。 结果: 1、在TGF-β浓度为5.0μg/L时，上皮细胞标志E-cadherin蛋白显著降低，间质细胞标志Vimentin蛋白和EMT进程转录因子Snail显著升高，并且NOX4蛋白和ROS水平升高（均P<0.001）；因此，本研究选择5.0μg/L浓度的TGF-β进行后续实验。 2、TGF-β 刺激A549 细胞后，与空白组相比，p38MAPK、p-p38MAPK、NF-κB(p65)、p-NF-κB(p-p65)的表达升高（均P<0.05）。 3、TGF-β+DPI组与TGF-β组相比，NOX4 mRNA水平、NOX4、p38MAPK、p-p38MAPK、NF-κB(p65)、p-NF-κB(p-p65)、Vimentin、Snail 蛋白表达降低，ROS水平下降，E-cadherin蛋白升高，（均P<0.001）；MTT结果显示，TGF-β+DPI组与TGF-β组相比，细胞的增殖活性降低（P<0.001）；划痕实验显示：TGF-β+DPI组与TGF-β组相比，细胞间划痕宽度变宽（P<0.001），说明其迁移能力降低。 4、TGF-β+SB203580组与TGF-β组相比，p38MAPK mRNA水平、p38MAPK、p-p38MAPK、NOX4、Vimentin、Snail蛋白表达降低，ROS水平下降，E-cadherin蛋白升高（均 P<0.001）；与此同时，细胞的增殖活性和迁移能力均降低（均P<0.001）。 5、TGF-β+BAY11-7082 组与 TGF-β 组相比，NF-κB(p65) mRNA 水平、NF-κB(p65)、p-NF-κB(p-p65)、NOX4、Vimentin、Snail蛋白表达降低，ROS水平下降，E-cadherin蛋白升高，（均P<0.001）；细胞的增殖活性和迁移能力均降低（均P<0.001）。 结论: 1、NOX4、p38MAPK、NF-κB(p65)可以介导A549细胞EMT进程，并且在TGF-β诱导A549细胞EMT进程中，NOX4与p38MAPK、NOX4与NF-κB(p65)之间相互影响，共同促进A549细胞EMT进程。 2、用DPI、SB203580、BAY11-7082分别抑制NOX4、p38MAPK、NF-κB(p65)可以逆转由TGF-β诱导的EMT进程，并降低A549细胞的增殖活性和迁移能力。

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