活性维生素D对D-半乳糖诱导的老年雄性大鼠睾丸功能影响的研究

摘要

背景: 衰老（aging）是一个随着时间增长，在机体的分子、细胞、组织、器官和系统各个水平中发生的不可逆的变化过程。在衰老的过程中，有相当比例的男性随着年龄的增长逐渐出现睾丸内分泌功能减退，体内雄激素水平的下降，患者出现性欲减退、勃起功能障碍、劳动耐力下降、骨质疏松、体脂增加、认知功能和记忆力下降，称为男性迟发型性腺功能减退（LOH），这严重影响了该类患者的生活水平和质量。男性性腺功能的下降与生殖系统内氧化应激损伤加重，抗氧化能力下降密切相关，已成为目前研究热点。 维生素 D3 与男性生殖关系密切。大量研究证实，维生素 D 受体（VDR）及维生素代谢酶被发现存在于睾丸间质细胞、支持细胞、生殖细胞、精子及男性生殖道上皮中。多项临床研究揭示，血清25(OH)D水平与体内总睾酮和游离睾酮呈正相关。对于VDR缺失的裸鼠，精子数量和活力明显降低，从而导致不育。Kelch 样环氧氯丙烷相关蛋白-1（Keap1）-核因子 E2 相关因子 2（Nrf2）/抗氧化反应元件（ARE）信号通路是机体内源性抗氧化应激的关键通路。在氧化应激状态下，Nrf2转位进入细胞核内，识别抗氧化反应原件（ARE），进而启动下游一系列靶基因的转录，调控 II 相代谢酶、抗氧化酶，如谷氨酸半胱氨酸 连接酶催化亚基（GCLC）、超氧化物歧化酶（SOD）、血红素加氧酶1（HO-1）、葡糖糖醛酸转移酶 1A6（NQO1）等的转录活性，从而发挥抗氧化损伤的作用。研究显示，Nrf2 基因敲除的小鼠加速了年龄相关的精子生成障碍及睾酮水平的降低，提示Nrf2在机体生殖系统氧化损伤中的关键作用。 研究显示，维生素D可激活Nrf2通路，延缓糖尿病肾病、支气管哮喘等多种疾病引起的氧化应激损伤。综上所述，维生素 D是否也可通过激活睾丸组织Nrf2-ARE通路，加强Nrf2作用，进而调节下游抗氧化蛋白的表达，改善老年大鼠睾丸功能减退？本研究通过D-半乳糖（D-gal）皮下注射构建大鼠亚急性衰老模型，分别予不同剂量的维生素D处理，旨在研究活性维生素D对老年大鼠睾丸功能及氧化应激水平的影响，并探究其是否通过Nrf2/ARE通路发挥作用。 目的: 观察活性维生素 D 对亚急性衰老大鼠睾丸功能的影响，并初步探究活性维生素D与睾丸氧化应激损伤的关系。 方法: 8周龄雄性SD大鼠，随机分为两组，一组连续8周颈背部皮下注射15%D-半乳糖溶液 500mg/（kg*d）制造亚急性衰老模型，另一组皮下注射等剂量的生理盐水作为正常对照。将造模成功后的亚急性衰老模型大鼠随机分为衰老模型组（DG）、衰老+低剂量维生素D组 （LD）、衰老+高剂量维生素D组（HD），将正常对照组随机分为正常对照组（NC）、正常+低剂量维生素D组（LC）、正常+高剂量维生素D组（HC）。LD组、LC组予骨化三醇0.025ug/（kg*d）溶于花生油灌胃，HD 组、HC 组予骨化三醇 0.1ug/（kg*d）溶于花生油灌胃，DG组、NC组予等量的花生油作为对照。8周后处死大鼠，分别称量体重、睾丸重量；取静脉血行生化、性激素检测；取大鼠附睾行精子参数分析；分光光度计法检测睾丸组织SOD、MDA含量；Western Blot检测睾丸组织VDR、Nrf2、GCLC、SOD2蛋白的表达；实时荧光定量PCR检测Nrf2 mRNA的表达；大鼠睾丸组织中性甲醛固定后行HE 染色观察形态学变化，免疫组化、免疫荧光检测 VDR、Nrf2蛋白的表达及定位。 结果: 1. 亚急性衰老模型的评价 与正常对照组相比，衰老模型组在注射D-半乳糖溶液后逐渐出现行动迟缓，毛发发黄，且褪毛严重。 注射D-半乳糖溶液8周后，处死大鼠，可观察到胸腺指数、肝脏指数较正常对照组下降。睾丸指数下降，血睾酮水平降低。 2. 活性维生素D对各组大鼠一般情况及睾酮水平的影响 DG组与NC组相比，睾丸重量明显下降（P＜0.05），睾丸指数（睾丸重量/体重）下降（P＜0.05）。补充维生素D之后可见，LD组和HD组睾丸重量和睾丸指数较DG组有所增加（P＜0.05）。LD组和HD组，LC组和HC组，各组间睾丸重量以及睾丸指数未见差异（P＞0.05）。各组间体重未见明显差异（P＞0.05）。 与NC组相比，DG组睾酮显著下降（P＜0.05），补充维生素D后可见HD和LD组，睾酮水平有所增加（P＜0.05）。DG组血钙水平较NC组无明显差异（P＞0.05），LD组及HD组较DG组血钙水平升高，LC组和HC组较NC组血钙水平升高（P＜0.05）。血磷水平各组间无统计学差异（P＞0.05）。 3. 活性维生素D对各组大鼠精子参数的比较 与NC组相比，DG组精子总数以及精子活动度下降（P＜0.05），补充维生素D后可见精子总数增加，活精子数增加（P＜0.05）。 4. 活性维生素D对各组大鼠睾丸组织SOD及MDA的影响 与NC组相比，DG组SOD酶活力下降（P＜0.05），补充维生素D后可见SOD酶活力增强（P＜0.05）。与NC组相比，DG组MDA含量增加（P＜0.05），补充活性维生素D后可见MDA含量下降（P＜0.05）。 5. 活性维生素D对各组大鼠睾丸结构的比较 HE 染色可见，DG 组大鼠睾丸组织生精小管萎缩，细胞层数减少，曲细精管管径缩小，管间间隙增宽，管内精子数目较少，间质区可见睾丸间质细胞稀少，间质增生。NC组大鼠睾丸组织结构完整，曲细精管饱满，管壁厚，生精细胞排列有序，管间含有丰富的精子。 6. 活性维生素D对各组大鼠睾丸组织Nrf2 mRNA的影响 PT-PCR结果显示，与NC组相比，DG组Nrf2 mRNA表达水平下降（P＜0.05）,补充维生素D后，可见LD组、HD组Nrf2 mRNA表达水平上升（P＜0.05）；LC组、HC组 Nrf2 mRNA 水平较NC组上升（P＜0.05）。 7. 活性维生素D对各组大鼠睾丸组织VDR、Nrf2、SOD2、GCLC蛋白的比较 与NC组相比，DG组Nrf2、SOD2、GCLC蛋白水平下降（P＜0.05），补充维生素D后可见LD组、HD组VDR、Nrf2、SOD2、GCLC蛋白水平较DG组上升（P＜0.05）。 8.各组大鼠睾丸组织VDR、Nrf2的表达及定位的比较 免疫组化及荧光结果显示，VDR、Nrf2 均表达于各组精细胞及精子中，细胞核和细胞浆中均有表达。与NC组相比，DG组睾丸组织中VDR、Nrf2蛋白表达下降，补充维生素D后可见，LD组、HD组睾丸组织VDR、Nrf2蛋白升高。 结论: 活性维生素D可改善D-半乳糖诱导的老年雄性大鼠睾丸功能减退。其机制 可能是通过增强Nrf2介导的抗氧化应激水平来实现的。

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