D-半乳糖诱导大鼠内耳氧化性应激、线粒体损伤和凋亡及长期高脂饮食对D-半乳糖诱导的老化大鼠内耳的影响

摘要

本文主要从以下几个部分展开论述：
　　第一部分 D-半乳糖诱导大鼠内耳氧化性应激、线粒体损伤和凋亡
　　目的:线粒体 DNA(mitochondrial DNA, mtDNA)的氧化性损伤和凋亡是老化的重要特征。之前利用连续8周注射 D-半乳糖(D-galactose, D-gal)的方法建立了大鼠老化模型,并且发现在 D-gal诱导的老化大鼠内耳中氧化性应激的增加和mtDNA常见缺失(common deletion, CD)的增加。但是,在 D-gal诱导的老化大鼠内耳中,目前没有直接的证据表明 mtDNA CD的累积是由氧化性损伤引起的;同时此模型内耳中活性氧(reactive oxygen species, ROS)的来源以及凋亡情况仍不清楚。
　　方法:听力正常,无中耳疾患的40只5周龄雄性 Spragua-Dawley大鼠随机分成2组(各20只):① D-半乳糖组(D-gal group):每日颈背部皮下注射 D-gal(500mg/kg),连续8周;②对照组(control group):每日颈背部皮下注射同体积的生理盐水,连续8周。听性脑干反应(auditory brainstem response, ABR)检测每组大鼠听功能。比色法检测大鼠血清 H2O2,总超氧化物歧化酶(total superoxide dismutase, T-SOD)活性以及丙二醛(malondialdehyde, MDA)含量。实时定量 PCR检测大鼠内耳 mtDNA CD的累积以及NADPH氧化酶3(NOX3)和P22phox mRNA水平的变化。透射电子显微镜检术(Transmission Electron Microscopy, TEM)观察大鼠内耳组织细胞中线粒体超微结构的改变。免疫组织化学法检测大鼠耳蜗8-羟基-2-脱氧鸟苷(8-hydroxy-2-deoxyguanosine,8-OHdG)以及NOX3和P22phox蛋白水平的变化。免疫印迹法检测大鼠内耳组织中激活型 caspase-3(cleaved caspase-3)的表达。原位末端转移酶标记( terminal deoxynucleotidyl transferase(TdT)-mediated deoxyuridine triphosphate(dUTP) nick-end-labelling, TUNEL)染色检测大鼠耳蜗细胞凋亡发生的情况。
　　结果:D-半乳糖组大鼠血清 H2O2和MDA含量比对照组明显增加,T-SOD水平比对照组明显降低,差异有统计学意义(P<0.01)。D-半乳糖组大鼠内耳组织中mtDNA CD累积比对照组明显增加,差异有统计学意义(P<0.01)。TEM发现 D-半乳糖组大鼠耳蜗组织细胞中线粒体表现为基质密度降低,甚至发生严重变性。D-半乳糖组大鼠耳蜗组织中8-OHdG、NOX3、P22phox和cleaved caspase-3的表达比对照组明显升高,差异有统计学意义(P<0.01)。TUNEL染色发现少量凋亡细胞局限于 D-半乳糖组大鼠耳蜗血管纹,而对照组大鼠耳蜗未发现凋亡细胞。两组大鼠ABR阈值差异无统计学意义(P>0.05)。
　　结论:在内耳老化过程中mtDNA CD的积累可能是 NADPH氧化酶相关的氧化性应激造成的,并且 caspase-3介导的细胞凋亡可能参与了内耳的老化过程。
　　第二部分 长期高脂饮食加重 D-半乳糖诱导的老化大鼠内耳氧化性应激,线粒体损伤和凋亡
　　目的:研究12个月的高脂饮食对 Sprague-Dawley大鼠内耳及D-半乳糖诱导的老化大鼠内耳的老化过程的作用。
　　方法:104只5周龄雄性 Spragua-Dawley大鼠随机分成4组(各26只):①对照组(control group):饲喂基础饮食12个月,前8周每日颈背部皮下注射和D-半乳糖组同体积的生理盐水;② D-半乳糖组(D-gal group):饲喂基础饮食12个月,前8周每日颈背部皮下注射 D-gal(500mg/kg);③高脂饮食组(HFD group):饲喂高脂饮食12个月,前8周每日颈背部皮下注射和D-半乳糖组同体积的生理盐水;④ D-半乳糖+高脂饮食组(D-gal+HFD group):饲喂高脂饮食12个月,前8周每日颈背部皮下注射 D-gal(500mg/kg)。造模结束后,听性脑干反应(auditory brainstem response, ABR)检测每组大鼠听功能;每组大鼠称重,比色法检测大鼠血清甘油三脂(triglycerides, TG),总胆固醇(total cholesterol, TC),游离脂肪酸(nonesterified fatty acids, NEFA)和H2O2含量;实时定量 PCR检测大鼠内耳 mtDNA CD的累积以及NADPH氧化酶3(NOX3), P22phox, uncoupling protein2(UCP2)和uncoupling protein3(UCP3)mRNA水平的变化;免疫组织化学法检测大鼠耳蜗 NOX3蛋白水平的表达;免疫印迹法检测大鼠内耳组织中NOX3, P22phox, UCP2, UCP3和激活型 caspase-3(cleaved caspase-3)的蛋白水平的表达;透射电子显微镜检术(Transmission Electron Microscopy, TEM)观察大鼠耳蜗血管纹边缘细胞线粒体超微结构的改变;原位末端转移酶标记(terminal deoxynucleotidyl transferase(TdT)-mediated deoxyuridine triphosphate(dUTP) nick-end-labelling, TUNEL)染色检测大鼠耳蜗细胞凋亡情况。
　　结果:D-半乳糖组和D-半乳糖+高脂饮食组大鼠ABR阈值在4,8,16和32 kHz比对照组升高,差异有统计学意义(P<0.05);高脂饮食组大鼠ABR阈值数值上在上述4个频率均比对照组升高,但仅在32 kHz差异有统计学意义(P<0.05);同时,D-半乳糖+高脂饮食组大鼠ABR阈值在16和32 kHz比 D-半乳糖组升高,差异有统计学意义(P<0.05)。高脂饮食组和D-半乳糖+高脂饮食组大鼠血清 TG、TC和NEFA水平比对照组和D-半乳糖组升高,差异有统计学意义(P<0.01);D-半乳糖组、高脂饮食组和D-半乳糖+高脂饮食组大鼠血清 H2O2水平比对照组升高,差异有统计学意义(P<0.01),其中D-半乳糖+高脂饮食组大鼠血清 H2O2水平最高,差异有统计学意义(P<0.01)。D-半乳糖组、高脂饮食组和D-半乳糖+高脂饮食组大鼠内耳组织 NOX3、P22phox、UCP2、UCP3和cleaved caspase-3的表达比对照组升高,其中D-半乳糖+高脂饮食组最高,差异有统计学意义(P<0.01)。D-半乳糖组、高脂饮食组和D-半乳糖+高脂饮食组大鼠内耳组织 mtDNA CD的累积比对照组增加,差异有统计学意义(P<0.05)。D-半乳糖组、高脂饮食组和D-半乳糖+高脂饮食组大鼠耳蜗血管纹边缘细胞线粒体有不同程度的肿胀,伴有线粒体基质密度降低。TUNEL染色发现 D-半乳糖组、高脂饮食组和D-半乳糖+高脂饮食组凋亡细胞比对照组明显增多,且凋亡细胞主要局限于血管纹;同时,在 D-半乳糖+高脂饮食组大鼠耳蜗 Corti器发现少量凋亡细胞。
　　结论:长期高脂饮食可诱导内耳氧化性应激、线粒体损伤和凋亡。长期高脂饮食可加速年龄相关性听力损失的进展。

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英文摘要

第一部分 D-半乳糖诱导大鼠内耳氧化性应激、线粒体损伤和凋亡

前 言

材料和方法

结 果

讨 论

参考文献

第二部分 长期高脂饮食加重D-半乳糖诱导的老化大鼠内耳氧化性应激，线粒体损伤和凋亡

前 言

材料和方法

结 果

讨 论

参考文献

综 述

1. 氧化性应激

2. 线粒体功能障碍

3. mtDNA突变

4. 线粒体“恶性循环”理论和线粒体介导的细胞凋亡

参考文献

附 录

致谢