miR-148a-3p对NK/T细胞淋巴瘤细胞生物学功能的影响

摘要

NK/T细胞淋巴瘤（Natural Killer/T cell lymphoma，NK/Tcl）是一类预后较差的非霍奇金淋巴瘤亚型，大部分来源于成熟的NK细胞，少部分来源于NK样T细胞，细胞表型具有高度异质性、复杂多样性。NK/Tcl好发于上呼吸道及消化道，临床表现各异，进展迅速，频繁复发，但诊疗进展缓慢。目前还缺乏更加有效的治疗靶点。MicroRNA（miRNA）是非编码RNA的重要组成部分，通过RNA的降解和（或）抑制翻译来调控基因表达。miRNA在肿瘤细胞和肿瘤细胞微环境的联系间起着重要作用，通过调控各种分子信号通路，释放肿瘤细胞因子或生长因子，从而调控肿瘤的发生发展。研究发现，部分miRNA在特定肿瘤中可发挥癌基因和抑癌基因的功能。 MiR-148a是miR-148/miR-152家族的成员，该家族是由三个高度保守的、成熟的miRNA组成，分为miR-148a、miR-148b及miR-152。miR-148a是一种新型的肌源性miRNA，可通过作用于靶蛋白ROCK1促进成肌细胞和骨骼肌细胞分化。同时，miR-148a可作用于不同的靶基因发挥其在各种肿瘤中的功能。近年来研究发现，miR-148a在胃癌、结直肠癌、胰腺癌、肝癌、乳腺癌、非小细胞肺癌中均检测到表达下调，而在骨肉瘤中的表达上调。且发现miR-148a在不同肿瘤细胞中可发挥癌基因或抑癌基因作用。而目前有关miR-148a-3p在NK/T细胞淋巴瘤中的作用无相关研究的报道，本文拟对miR-148a-3p在NK/T细胞淋巴瘤中的生物学功能进行研究。 目的： 鉴于miR-148a-3p在NK/T细胞淋巴瘤细胞中无相关研究报道。本文拟以体外实验方法对miR-148a-3p在NK/T细胞淋巴瘤细胞的表达及功能进行研究。进一步阐明miR-148a-3p功能并以寻找NK/T细胞淋巴瘤新的治疗靶点。 方法： 1.NK/T细胞淋巴瘤细胞株NK92细胞及YT细胞均由淋巴瘤重点实验室（张明智，郑州大学第一附属医院肿瘤科）馈赠，正常人NK细胞株购于中国科学院细胞库。以慢病毒为介导的LV3-miR-148a-3p mimics过表达及LV3-miR-148a-3p inhibitor干扰载体购于上海吉玛公司。 2.利用qRT-PCR方法检测miR-148a-3p在NK/T细胞淋巴瘤细胞NK92细胞、YT细胞及正常人NK细胞中的表达情况。 3.以慢病毒为介导的过表达载体（LV3-miR-148a-3p mimics）、敲除载体（LV3/anti-hsa-miR-148a-3p）分别感染YT细胞、NK92细胞，感染后检测miR-148a-3p的表达情况及YT、NK92细胞增殖能力、细胞迁移能力、细胞侵袭能力、细胞凋亡的影响。 4.SPSS21.0软件进行统计学分析。miR-148a-3p的相对表达量三组细胞间均数的比较采用单因素方差分析。得出结果用均值±标准差表示。当P＜0.05时，可认为样本间的差异具有统计学意义。所有实验至少重复3-5次。 结果： 1.MiR-148a-3p在正常NK细胞、YT细胞、NK92细胞中的相对表达量分别为8.62±0.35、14.55±0.27、24.48±0.44，NK92细胞中的相对表达量显著高于其它两组细胞(P＜0.05)。miR-148a-3p在NK/T细胞淋巴瘤细胞中表达明显升高，NK92细胞表达量约是对照组3倍，YT细胞的表达量约是对照组的1.7倍（P＜0.05）。 2.用各修饰慢病毒感染NK/T细胞淋巴瘤的YT细胞后，检测敲除组（LV3/anti-hsa-miR-148a-3p）、过表达组（miR-148a-3p）、阴性对照组（LV3-NC）的相对表达量分别是4.84±0.4、21.55±0.33、10.01±0.69，与敲除组、阴性对照组比较，过表达组在YT细胞中表达显著升高（P＜0.05）。用各修饰慢病毒感染NK/T细胞淋巴瘤的NK92细胞后，检测敲除组（LV3/anti-hsa-miR-148a-3p）、过表达组（miR-148a-3p）、阴性对照组（LV3-NC）相对表达量分别是8.44±0.3、31.13±0.52、11.11±0.5，与过表达组、对照组比较，敲除组在NK92细胞中表达显著降低（P＜0.05）。 3.CCK-8检测miR-148a-3p对YT、NK92细胞增殖活性的影响，过表达组（miR-148a-3p）与阴性对照组（LV3-NC）比较，过表达组细胞增殖活性明显升高，敲除组（LV3/anti-hsa-miR-148a-3p）与阴性对照组（LV3-NC）比较，敲除组细胞增殖活性明显降低。 4.Transwell小室检测miR-148a-3p对YT、NK92细胞迁移能力的影响。过表达组（miR-148a-3p）与敲除组（LV3/anti-hsa-miR-148a-3p）、对照组（LV3-NC）比较，过表达组细胞的迁移能力显著升高。 5.Transwell小室铺基质胶检测miR-148a-3p对YT、NK92细胞侵袭功能的影响。过表达组（miR-148a-3p）与敲除组（LV3/anti-hsa-miR-148a-3p）、对照组（LV3-NC）比较，过表达组细胞的侵袭能力显著升高。 6.利用Annexin V-PE/7-AAD双染法检测miR-148a-3p对NK/T细胞淋巴瘤细胞系凋亡的影响。在YT细胞中，敲除组（LV3/anti-hsa-miR-148a-3p）、过表达组（miR-148a-3p）、阴性对照组（LV3-NC）细胞凋亡比例分别为14.2±0.84%，2±0.5%，5.2±0.57%，结果表明，敲除组LV3/anti-has-miR-148a-3p感染YT细胞后，细胞凋亡比例显著增加；在NK92细胞中，敲除组（LV3/anti-hsa-miR-148a-3p）、过表达组（miR-148a-3p）、阴性对照组（LV3-NC）细胞凋亡比例分别为54.8±3.96%，43.4±0.55%，44.1±1.08%，结果表明，敲除组LV3/anti-hsa-miR-148a-3p感染NK92后，细胞凋亡比例显著增高。在NK/T细胞淋巴瘤YT、NK92细胞中，LV3/anti-hsa-miR-148a-3p敲除组细胞凋亡比例显著增高，miR-148a-3p过表达组细胞总凋亡比例显著降低，敲除组细胞总凋亡比例显著升高（P＜0.05）。 结论： 1.MiR-148a-3p在NK/T细胞淋巴瘤细胞中表达显著升高，提示miR-148a-3p可能参与了NK/T细胞淋巴瘤的发生进展。 2.抑制NK92细胞、YT细胞中miR-148a-3p的表达可抑制细胞增殖、迁移、侵袭及促进细胞凋亡，提示miR-148a-3p在NK/T细胞淋巴瘤细胞中可发挥癌基因作用，并有望成为NK/T细胞淋巴瘤的新的治疗靶点。

目录

声明

中英文缩略词表

前言

实验材料与方法

1 实验材料

1.1 细胞系

1.2 MIRNA探针

1.3 rtRCR引物

1.4 细胞培养用液

2 实验方法

2.1 细胞培养（悬浮细胞）

2.2 总RNA提取

2.3 实时荧光定量PCR检测NK/T细胞淋巴瘤细胞系中miR-148a-3p的表达

2.4 慢病毒感染NK/T细胞淋巴瘤细胞系检测miR-148a-3p的表达量

2.5 慢病毒感染NK/T细胞淋巴瘤细胞系检测细胞增殖功能

2.6 慢病毒感染NK/T细胞淋巴瘤细胞系检测细胞迁移实验

2.7 慢病毒感染NK/T细胞淋巴瘤细胞系检测细胞浸润实验

2.8 慢病毒感染NK/T细胞淋巴瘤细胞系检测细胞凋亡实验

2.9 数据处理方法

实验结果

1 利用qRT-PCR方法检测miR-148a-3p在NK/T细胞淋巴瘤细胞系中的表达情况

2 用各修饰慢病毒感染NK/T细胞淋巴瘤细胞系后qRT-PCR方法检测miR-148a-3p的表达情况

3 用各修饰慢病毒感染NK/T细胞淋巴瘤细胞后CCK8法检测细胞增殖

4 慢病毒感染NK/T细胞淋巴瘤后检测细胞迁移能力

5 慢病毒感染NK/T细胞淋巴瘤后检测细胞侵袭能力

6 慢病毒感染NK/T细胞淋巴瘤后利用Annexin V-PE/7-AAD双染法检测细胞凋亡

讨论

结论

参考文献

综述:microRNA 在肿瘤中的研究进展

参考文献

个人简历

致谢