旋毛虫组织蛋白酶B的克隆表达及在幼虫侵入小鼠肠上皮细胞中的作用

摘要

目的： 旋毛虫病是一种食源性人兽共患寄生虫病，主要是由于生食或半生食含囊包幼虫的肉类所致。旋毛虫可引起发热、面部水肿、肌肉疼痛等多种临床表现，严重感染可因并发症而死亡。幼虫是旋毛虫的主要致病阶段，寻找幼虫在侵入肠黏膜过程中起到关键作用的蛋白酶尤为重要，组织蛋白酶B是木瓜蛋白酶样的半胱氨酸蛋白酶，前期研究发现组织蛋白酶B能够降解宿主的黏连蛋白、纤连蛋白、Ⅰ型和Ⅳ型胶原蛋白，与寄生虫的侵入与组织内移行有关，由此推测该蛋白可能参与了旋毛虫入侵宿主。本研究克隆表达了旋毛虫组织蛋白酶B（TsCB），并对其生物信息学性质进行了分析，利用纯化后的重组TsCB（rTsCB）制备免疫血清，然后对TsCB进行免疫荧光定位、RT-PCR分析，并研究其与小鼠肠上皮细胞（IECs）的结合作用以及在侵入IECs中的功能，从而探究TsCB在旋毛虫入侵宿主IECs的作用。 方法： 1.旋毛虫虫种、实验动物、细胞及菌株 本实验所用旋毛虫虫种为河南南阳猪源地理株，实验动物包括昆明小鼠、BABL/c小鼠，均购自河南省实验动物中心，细胞为本实验分离传代得到的小鼠IECs，rTsCB表达菌株为BL21。 2.TsCB生物信息学分析 利用ExPasy网站对TsCB蛋白的基本理化性质进行预测分析；在SignalP4.1Server预测TsCB是否具有信号肽；在TMHMM网站预测TsCB蛋白跨膜结构；利用SWISS-MODEL网页预测TsCB的二级结构和三级结构；在NCBI中找到TsCB（Tsp-03306）相关信息，预测其酶活性位点。使用BioEdit软件，将旋毛虫组织蛋白酶B与人、小鼠和其他寄生虫的组织蛋白酶B进行序列比对和系统发育进化树分析。 3.TsCB的克隆表达及抗原性分析 将TsCB基因连接到表达载体pQE-80L，原核表达出重组蛋白rTsCB，经镍柱亲和纯化后免疫小鼠制备小鼠抗rTsCB免疫血清，并收集ML粗抗原和ES抗原，进行SDS-PAGE和Western blot实验，分析rTsCB的抗原性。 4.TsCB在旋毛虫各虫期的表达及荧光免疫定位 通过RT-PCR分析TsCB基因在不同虫期[肌幼虫（ML）、肠道感染性幼虫（IIL）、成虫（AW）、新生幼虫（NBL）]的转录水平，收集不同虫期的虫体，将新鲜虫体制成石蜡切片，进行IFA实验检测TsCB在旋毛虫不同发育阶段的表达及定位情况。 5.TsCB与IECs的结合作用及其在旋毛虫侵入IECs中的作用 通过ELISA、Western blot、Far-Western和荧光共聚焦显微镜检查，将TsCB与IECs孵育后检测两者结合情况，并通过分离的IECs胞浆与胞核，进一步验证TsCB和IECs的相互作用。然后进行体外幼虫侵入实验，将IIL幼虫加入DMEM半固体培养基中，覆盖于IECs单层表面，在培养基中同时分别加入rTsCB和rTsCB免疫血清，孵育2h后镜下观察幼虫对IECs的侵入。 6.干扰TsCB基因的表达对IIL侵入IEC的阻断作用 设计小干扰RNA（siRNA596），沉默TsCB在肌幼虫的表达，确定siRNA596干扰的最佳浓度和持续时间，将干扰后的ML进行体外侵入实验，观察沉默TsCB基因的表达对幼虫侵入IEC的阻断作用。 结果： 1.TsCB生物信息学分析 TsCB（accession No:NW_003526941.1）基因的生物信息学软件及在线网站分析预测结果显示，TsCB基因序列全长1071bp，编码356个氨基酸，分子量约为40.23kDa，等电点为7.86。具有信号肽（1-29aa），N端有明显的疏水区，有1个跨膜区（12-35aa），存在有1个肽酶（peptidase_C1A）的结构功能域，位于102-351aa，定位于细胞膜外。TsCB二级结构包含有7个α-螺旋、13个β-折叠，三级结构预测有4个酶活性位点分别为：组氨酸（His）、谷氨酰胺（Gln）、半胱氨酸（Cys）、天冬酰胺（Asn），他们紧密排布于该蛋白分子空间结构中。 2.TsCB的克隆表达及抗原性分析 将TsCB基因连接到克隆载体pMD19-T中，双酶切后将TsCB连接到表达载体pQE-80L，构建重组表达质粒pQE-80L/TsCB，转入感受态细胞中，将阳性克隆菌进行测序鉴定，将连接成功的单菌落加2mM IPTG，37℃诱导6h后收集菌体进行SDS-PAGE，发现pQE-80L/TsCB在39.7kDa处出现一条蛋白带，可溶性分析显示rTsCB以包涵体形式存在，将rTsCB免疫小鼠制备鼠抗rTsCB血清。Western blot分析显示，纯化后的rTsCB蛋白可被抗rTsCB血清识别，但不能被旋毛虫感染小鼠血清识别，与正常小鼠血清无交叉反应；抗rTsCB血清可识别旋毛虫不同期虫体（ML，IIL，AW，NBL）粗抗原中天然的TsCB，但不能识别ES抗原中的TsCB，表明TsCB是旋毛虫虫体蛋白中的成份。 3.TsCB在旋毛虫各虫期的表达及荧光免疫定位 RT-PCR结果表明TsCB基因在旋毛虫不同期虫体（ML，IIL，AW，NBL）均有转录，虫体切片免疫荧光显示TsCB主要定位于虫体杆状体、皮层和雌成虫的胚胎。 4.间接ELISA检测rTsCB与IECs的结合 用不同浓度IECs包板，与10μg/mL rTsCB孵育后，ELISA结果表明IECs蛋白最佳包被浓度为3.2μg/mL。然后以此浓度包板，与不同浓度的rTsCB蛋白孵育，结果表明rTsCB浓度达到1.75μg/mL时，rTsCB与IEC蛋白充分结合。OD值随着IEC包被浓度的增加而升高（F=298.187，P<0.01），两者具有相关性(r=0.743，P<0.05)；此外，OD值也随着rTsCB孵育浓度的加大而增加（F=458.891，P<0.01），二者也具有显著相关性(r=0.953，P<0.01)，表明重组蛋白可以和IECs结合。 5.Western blot分析rTsCB与IECs的特异性结合 rTsCB与活的IECs孵育2h后，Western blot实验显示抗rTsCB免疫血清识别了7条IECs的蛋白带，而感染血清识别了5条带，正常血清不能识别。然而，抗rTsCB血清不能识别经BSA孵育后的IECs蛋白。将IECs胞浆蛋白和胞核蛋白分别与rTsCB孵育后进行的Western blot结果显示，抗rTsCB血清分别识别5条胞浆蛋白带和3条胞核蛋白带，表明TsCB与IECs的结合位点是在IEC胞浆与胞核。 6.Far western和IFA验证rTsCB与IECs相互作用 Far-Western结果显示IECs蛋白能被抗rTsCB血清和旋毛虫感染小鼠血清识别，但不能被正常小鼠血清识别；抗rTsCB血清能识别IEC全细胞蛋白中的8条带，胞浆蛋白中的7条和胞核蛋白中6条带，再次表明rTsCB能够与IECs结合，共聚焦显微镜检查发现，rTsCB能够与IECs特异性结合，更加直观形象的表明rTsCB能够与IEC结合，结合部位在的IECs的胞浆与胞核。 7.rTsCB与抗rTsCB血清对旋毛虫体外侵入IECs的促进与抑制作用 体外侵入结果表明，rTsCB对IIL幼虫侵入IECs有显著地促进作用，这种促进作用呈剂量依赖性（r=0.985，P<0.01），且随着抗rTsCB蛋白浓度的增加，促进侵入作用增强（F=341.596，P<0.01），但BSA并无促进幼虫入侵作用。 将IIL加入IECs单层后幼虫能够侵入细胞单层。与PBS组相比较，抗rTsCB血清（1:100-1:600）能够明显抑制幼虫的对IECs侵袭（P<0.01）。抗rTsCB抗体的抑制作用呈剂量依赖性（r=0.974，P<0.01），随着血清稀释度的增加呈下降趋势（F=90.963，P<0.01）。此外，小鼠免疫前血清和单佐剂免疫小鼠血清对幼虫入侵无明显的抑制作用。 结论： 1.成功构建了旋毛虫组织蛋白酶B（TsCB）重组原核表达质粒PQE-80L/TsCB，并诱导表达出rTsCB； 2.TsCB在旋毛虫各个发育时期均有表达，主要定位于虫体杆状体、皮层和雌虫的胚胎； 3.rTsCB能够与小鼠肠上皮细胞特异性结合，对旋毛虫侵入肠上皮细胞有明显的促进作用，而抗rTsCB血清能够显著抑制幼虫对肠上皮细胞的侵入；沉默TsCB基因亦明显抑制了旋毛虫对小肠上皮细胞的侵入；rTsCB对小鼠具有较好的免疫保护作用。因此，TsCB是旋毛虫侵入宿主肠上皮细胞的相关蛋白。

目录

声明

Abstract

1前言

1.1 旋毛虫及旋毛虫病

1.2 组织蛋白酶B

1.3 组织蛋白酶B在寄生虫中的研究

1.4 本研究目的和内容

2 实验材料

2.1 旋毛虫虫种、实验动物和细胞系

2.2 主要实验仪器

2.3 主要实验试剂

2.4 实验主要试剂配方

2.4.1 收集旋毛虫肌幼虫及RNA提取所需试剂

2.4.2 PCR及琼脂糖凝胶电泳所需试剂

2.4.3 配置LB培养基

2.4.4 蛋白诱导表达所用试剂

2.4.5 提取质粒所用试剂

2.4.6 纯化蛋白所需试剂

2.4.7 SDS-PAGE所需试剂

2.4.8 Westernblot试剂

2.4.9 间接免疫荧光所需试剂

2.4.10 ELISA实验试剂

2.4.11 细胞培养及侵入实验所需试剂

2.4.12 RNA干扰实验所需试剂

3 实验方法

3.1 生物信息学分析

3.1.2 进化树的构建

3.2 TsCB基因的克隆

3.2.1 TsCB基因的引物设计

3.2.2 旋毛虫RNA的提取

3.2.3 扩增TsCB基因

3.2.4 重组菌（pQE-80L-TsCB/BL21）连接转化和鉴定

3.2.6 菌种冻存

3.3 TsCB基因原核表达及纯化

3.3.1 诱导表达rTsCB

3.3.2 rTsCB的可溶性分析

3.3.3 rTsCB诱导条件优化

3.3.4 纯化rTsCB

3.3.5 SDS-PAGE实验

3.3.6 考马斯亮蓝G-250测定蛋白浓度

3.4 抗rTsCB血清制备、效价检测和免疫类型分析

3.4.1 抗rTsCB血清制备

3.4.2 ELISA检测rTsCB免疫血清的效价及免疫类型检测

3.5 rTsCB的抗原性分析

3.5.1 收集旋毛虫肌幼虫（ML）

3.5.2 旋毛虫ML粗抗原的制备

3.5.3旋毛虫ML ES蛋白的制备

3.5.4Western blot

3.6 TsCB基因在旋毛虫不同虫期的表达—RT-PCR

3.6.2 提取各虫期RNA并反转录为cDNA

3.7 IFA检测旋毛虫不同发育时期TsCB及表达及定位

3.7.1 TsCB在旋毛虫不同发育时期虫体表面的表达

3.7.2 TsCB在旋毛虫不同发育时期的虫体定位

3.8 rTsCB与小鼠肠上皮细胞结合

3.8.1小鼠肠上皮细胞（IECs）的培养

3.8.2 ELISA检测rTsCB与IEC的结合

3.8.3 Western检测rTsCB与IEC的相互作用

3.8.4 Far-Western检测rTsCB与IEC的相互作用

3.8.5 IFA验证rTsCB与IECs的结合

3.9 rTsCB及其免疫血清对旋毛虫幼虫侵入肠上皮细胞影响

3.10 沉默TsCB基因的表达对IIL侵入IEC阻断作用

3.10.2电穿孔法导入siRNA

3.10.3 Western blot检测TsCB基因表达水平

3.10.4 TsCB基因沉默对肌幼虫侵入IECs的影响

3.11 rTsCB的免疫保护作用

4 实验结果

4.1 TsCB生物信息学分析

4.1.1 TsCB基本理化性质和结构功能分析

4.2 构建TsCB系统进化树

4.3 TsCB的克隆

4.3.1 设计引物

4.3.2 TsCB基因的扩增

4.3.3 验证重组菌

4.4 rTsCB的原核表达及纯化

4.4.1 rTsCB诱导表达

4.4.2 rTsCB可溶性分析

4.4.3 纯化rTsCB蛋白

4.5 rTsCB免疫血清的效价测定

4.5.1 测定最佳蛋白包被浓度

4.5.2 测定Cut off值

4.5.3 rTsCB抗体血清效价测定

4.6 rTsCB抗原性分析

4.6.1 rTsCB免疫血清识别天然虫体可溶、ES

4.6.2 rTsCB 免疫血清识别旋毛虫各个虫期虫体可溶蛋白

4.7 RT-PCR检测TsCB基因在旋毛虫不同虫期的表达

4.8 IFA分析TsCB在旋毛虫不同发育时期的表达和定位情况

4.8.1 TsCB在旋毛虫不同发育时期虫体表面的表达

4.8.2 TsCB在旋毛虫不同发育时期的虫体定位

4.9 rTsCB与小鼠肠上皮细胞结合及相互作用

4.9.1 ELISA检测rTsCB与IEC的结合

4.9.2 Westernblot检测rTsCB与IEC的结合

4.9.3 Far-Western检测rTsCB与IEC的相互作用

4.9.4 IIFA检测rTsCB与IEC的结合作用

4.10 rTsCB及其免疫血清对旋毛虫幼虫侵入肠上皮细胞影响

4.10.1 rTsCB对旋毛虫侵入肠上皮细胞的促进作用

4.10.2 rTsCB免疫血清对旋毛虫侵入肠上皮细胞的抑制作用

4.11干扰TsCB基因的表达对IIL侵入IEC阻断作用

4.11.1siRNA 596的设计

4.11.2不同浓度siRNA 596干扰效果

4.11.3 siRNA 596干扰不同天数的效果

4.11.4沉默TsCB基因后肌幼虫体外存活情况

4.11.5siRNA 596干扰体外侵入实验

4.12 rTsCB诱导的免疫类型及免疫保护作用分析

4.12.1 rTsCB诱导免疫类型检测

4.12.1 rTsCB的免疫保护作用

5 讨论

6 结论

参考文献

综述:组织蛋白酶的研究进展

个人简历及硕士期间发表学术论文情况

致谢