小麦A基因组中γ类醇溶蛋白基因的克隆及其对小麦面筋品质的影响

摘要

小麦作为世界上主要的粮食作物之一，可以制作成面包、馒头、蛋糕等制品，这种多样的加工品质特性主要受籽粒中面筋品质的影响。面筋品质由面筋所含的谷蛋白和醇溶蛋白共同决定，然而，编码醇溶蛋白的基因作为多基因家族，具有拷贝多、序列相似性高等特点，且普通小麦（Triticum aestivum）作为异源六倍体，基因组庞大、遗传背景复杂，对于醇溶蛋白多基因家族的鉴定及分析带来了困难。鉴于上述因素，本研究使用已经测序的普通小麦A基因组祖先种乌拉尔图小麦（Triticum urartu）作为研究材料，对编码醇溶蛋白主要成员之一的γ类醇溶蛋白多基因家族进行克隆，并分析其对小麦面筋品质的影响。 通过简并PCR扩增及序列比对分析，共鉴定到99条γ类醇溶蛋白基因。基于基因的多序列比对和进化树构建，分析发现该类多基因家族可分为4组，两大类，其中分组1、2、3归为一类，均含有乌拉尔图小麦中已报道的γ类醇溶蛋白基因，而4单独归为一类，不含有已报道的基因，可能属于新型γ类醇溶蛋白的多基因类别。 通过对这些基因的表达模式分析，发现在15天小麦籽粒中，分组1、2、3、4的基因表达水平依次降低。基于多基因具有不同的表达模式，本研究利用重亚硫酸盐测序（Bisulfite Sequencing）的方法对分组1和分组4的预测启动子序列甲基化水平进行了分析，研究结果显示分组1启动子序列甲基化水平显著低于分组4，并含有分组4没有的醇溶蛋白基因表达的核心顺式作用元件Prolamin-box，综合表明，γ类醇溶蛋白基因的表达可能受到启动子区域甲基化及顺式作用元件的调控。 为了探究γ类醇溶蛋白基因对小麦面筋品质的效应，本研究使用转录组测序的方法检测这些基因在自然群体（120份不同小麦）中的表达水平（自花授粉后20天籽粒），并与该自然群体的各项面筋品质指标进行相关性分析，结果显示，γ类醇溶蛋白基因的表达水平与最大面筋扭矩（BEM）、面团形成时间及稳定时间表现为显著负相关，表明γ类醇溶蛋白基因的表达负向影响小麦面筋品质表现。利用γ类醇溶蛋白基因在自然群体中的表达量作为表型，进行全基因组关联分析，共检测到86个影响γ类醇溶蛋白基因表达的显著有效位点，其中，67个分布在小麦第一同源染色体群，3个位于小麦第六同源染色体群的6A染色体上，其余16个位点则分布在染色体2A、3D、4A、5A、5B、7A、7B和7D上。

目录

声明

1 文献综述

1.1 小麦醇溶蛋白研究现状

1.1.1 小麦籽粒蛋白分类

1.1.2 小麦醇溶蛋白基因的染色体定位

1.1.3 小麦醇溶蛋白对小麦面筋品质的影响

1.1.4 小麦醇溶蛋白的一级结构

1.1.5 小麦醇溶蛋白与乳糜泻

1.2 转录组测序

1.3 基因芯片技术

1.4 全基因组关联分析

1.5 本研究的目的与意义

2 γ类醇溶蛋白基因的克隆及序列分析

2.1 材料

2.1.1 材料

2.1.2 主要试剂

2.1.3 主要仪器

2.2 方法

2.2.1 DNA提取

2.2.2 引物设计与合成

2.2.3 γ类醇溶蛋白基因的PCR扩增

2.2.4 目的DNA片段的回收

2.2.5 目的DNA片段的连接

2.2.6 连接产物的转化

2.2.7 菌落PCR检测阳性单克隆

2.2.8 序列分析

2.3 结果与分析

2.3.1 乌拉尔图小麦中γ类醇溶蛋白基因扩增结果及序列汇总

2.3.2 多序列比对及序列分析

2.3.3 进化树构建与聚类分析

2.3.4 乳糜泻抗原表位的预测

2.4 小结

3 γ类醇溶蛋白基因表达模式的分析

3.1 材料

3.1.1 材料

3.1.2 主要试剂

3.1.3 主要仪器

3.2 方法

3.2.1 实时荧光定量PCR

3.2.2 启动子甲基化分析

3.3 结果与分析

3.3.1 γ类醇溶蛋白基因在乌拉尔图小麦不同组织中的表达趋势

3.3.2 γ类醇溶蛋白基因启动子甲基化频率及顺式调控元件分析

3.4 小结

4 γ类醇溶蛋白对小麦面筋品质的影响

4.1 材料

4.1.1 材料

4.1.2 主要试剂

4.1.3 主要仪器

4.2 方法

4.2.1 转录组测序

4.2.2 小麦面筋品质指标检测

4.3 结果与分析

4.3.1 品质指标在不同小麦品种间的变异与相关性

4.3.2 γ类醇溶蛋白基因在120个品种内的表达量

4.3.3 γ类醇溶蛋白基因的表达量与不同品质数据间的相关分析

4.4 小结

5 γ类醇溶蛋白基因表达量的全基因组关联分析

5.1 材料

5.2 方法

5.3 结果与分析

5.4 小结

6 讨论与结论

6.1 γ类醇溶蛋白基因在普通小麦A基因组中的拷贝与分类

6.2 γ类醇溶蛋白基因的表达特点及其与小麦面筋品质间的关系

6.3 影响γ类醇溶蛋白基因表达水平的因素及关键位点的检测

6.4 结论

参考文献

附录

个人简历

致谢