离子束照射诱变技术构建生物乙醇高产酵母菌株

摘要

燃料乙醇的开发和利用以后将会是一个重要的生物能来源。本课题就是从利用酵母菌发酵生产酒精的角度，培育出一株能够有效利用五碳糖和六碳糖的酵母菌来发酵生产生物乙醇。
　　本实验从酒精酵母(Saccharomyces cerevisiae)的二倍体入手，培育筛选出随机孢子，分析鉴定得到单倍体并对其进行发酵性能进行测定，筛选出一株发酵性能相对较好的单倍体A-06。
　　对亲本菌株酿酒酵母的原生质体A-06和嗜鞣管囊酵母(Pachysolen tannophilus)B-12的原生质体的形成条件进行测定，其培养其最佳条件为：摇床震荡培养12 h的菌体，2％的蜗牛酶和2％的纤维素酶的混合酶液30℃水浴酶解1 h，原生质体的形成率分别为94.7％和92.5％。之后对亲本的细胞融合的最佳的培养条件进行对比测定，测定其最佳的培养条件为27℃，pH6.0～6.5，摇床震荡培养120 rpm。
　　采用两种不同的灭活方法对亲本菌株的原生质体进行融合。利用不同剂量和时间的紫外线灭活的方法对亲本酒精酵母A-06的原生质体进行彻底灭活，最佳的灭活条件为30 W紫外灯下距离30cm垂直照射1 min。采用高温水浴的方法对亲本管囊酵母B-12的原生质体进行彻底灭活，最佳灭活条件为65℃水浴1 h。
　　利用PEG作为促融剂诱导灭活双亲的原生质体进行融合，经过TTC平板颜色反应的初筛、复筛及特征性蛋白电泳的鉴定，获得一株能够进行木糖发酵的性能优良的融合子菌株C-05。经过测定，其酒精发酵度达到1.26 ml/100 ml，比亲本B-12提高了8.04％。
　　而后采用紫外线照射C-05对其进行诱变，经过多重筛选并测定，发现酒精产率变化不大，并没有成功诱变出理想菌株。
　　通过不同剂量的氮离子束照射融合子，并统计照射后的致死率，根据照射后的处理致死率，其中剂量为8×1015，照射时间为512 s的致死率最高，达到98.4％。培育并筛选其子代菌株，并测定其子代菌株的遗传稳定性。
　　最后利用含有不同浓度木糖和葡萄糖比例的培养液进行菌体发酵性能的测定，最终筛选出一株能够稳定遗传的子代菌株D-08。诱变后的子代菌株其酒精产率和亲本相比提高了10％，同时木糖利用率也有所提高。