不同EV71灭活疫苗诱导小鼠TLRs应签的比较研究

摘要

肠道病毒71型(EV71)是小儿手足口病(HFMD)的主要病原体之一，在世界范围内流行，亚太地区为主要流行区。EV71感染和发病人群主要为5岁以下婴幼儿。EV71感染可引起无菌性脑膜炎、脑干脑炎、神经性肺水肿和脊髓灰质炎样麻痹等多种神经系统疾病，有较高的致残率、致死率，被认为是脊髓灰质炎病毒之后影响儿童健康最主要的肠道病毒之一。我国是最早开展EV71疫苗研发的国家，目前3个厂家的全病毒灭活疫苗即将完成Ⅲ期临床试验。但对该疫苗的基础研究较为滞后，免疫机制仍不十分清楚，成为全面评价疫苗免疫原性及安全性的瓶颈。
　　 Toll样受体(TLRs)，是模式识别受体(PRRs)的一种。处于沟通固有免疫与获得性免疫的核心地位，TLRs信号通路的激活不仅诱导机体产生炎症反应，同时也促进DC的成熟与Th细胞的分化，产生获得性免疫应答病源体入侵机体时与相应的PRRs特异结合，激活体内免疫信号调节通路，最终诱导机体产生炎症反应。在对麻疹、黄热、风疹、乙肝等疫苗免疫机制的研究中，均发现存在特异激活的TLRs信号通路。有研究表明黄热疫苗高效的免疫原性与其可同时激活多条TLRs通路相关。此外将TLRs配体作为更加安全、有效的新型疫苗佐剂的研究也成为疫苗学研究的热点，葛兰素史克公司生产的添加了TLRs配体佐剂-ASO4的乙肝疫苗Fendrix已在欧盟获得批准。我国EV71疫苗研发进程居世界领先，但目前仍不了解疫苗诱导免疫应答与TLRs信号通路的关系。
　　 本研究成功设计了小鼠TLR4、7和9引物与探针，分别构建了包含TLR4，7，9基因的重组质粒，并在大肠杆菌中成功克隆了该质粒。引物、探针与重组质粒构成了小鼠TLR4、7和9基因检测的定量PCR(Q-PCR)平台。通过微量中和细胞病变法(CPE)对接种EV71抗原的小鼠血清中和抗体水平进行了测定，证明不同EV71抗原在接种剂量下皆可诱导小鼠产生中和抗体，且接种后3d阳转率即达到100％，据此判断TLRs通路的激活应发生在接种后3d内，因而对小鼠TLR4，7，9基因检测应在接种或刺激后3d内进行。
　　 运用Q-PCR平台对体外经EV71抗原刺激3d内不同时间点的小鼠脾淋巴细胞中TLR4、7和9基因表达水平进行了定量检测，发现TLR4、7和9基因活化水平在不同EV71抗原中存在差异，提示TLR4、7和9基因在不同EV71抗原免疫应答过程可能发挥不同的作用，并且TLR4、7和9基因活化水平与刺激抗原量之间存在剂量效应关系，该结果在基因敲除小鼠上得到了验证。对TLR4、7和9信号通路在不同EV71疫苗免疫应答过程中活化作用的研究，初步揭示了EV71疫苗的免疫机制。

目录

摘要

缩略语表

第一章 引言

1．1 EV71概述

1．2 TLRs与疫苗

1．3 立题依据

第二章 材料、仪器和方法

2．1 材料

2．1．1 EV71疫苗

2．1．2 EV71疫苗原液

2．1．3 试验动物

2．1．4 细胞

2．1．5 试剂盒

2．1．6 主要试剂

2．2 仪器

2．3 方法

2．3．1 TLR4、7、9定量PCR平台的建立

2．3．2 小鼠接种EV71后血液中中和抗体水平动态变化

2．3．3 EV71原液体外刺激小鼠MNC后TLR4、7、9表达水平的检测

2．3．4 体外刺激物浓度与TLR4、7、9基因表达水平的剂量效应关系

2．3．5 EV71疫苗体内免疫小鼠后脾淋巴细胞中TLR4、7、9表达水平的检测

2．3．6 TLR4、7、9基因敲除小鼠接种EV71疫苗后中和抗体水平研究

第三章 结果

3．1 TLR4、7、9定量PCR平台的建立

3．1．1 TLR4、7、9引物探针序列

3．1．2 RNA完整性检验

3．1．3 TLR4、7、9以及GAPDH基因的普通PCR结果

3．1．4 测序结果

3．2 接种EV71后小鼠血清中中和抗体水平动态变化

3．3 EV71原液体外刺激小鼠MNC后TLR4、7、9表达水平的动态变化

3．4 体外刺激物浓度与TLR4、7、9基因表达水平的剂量效应关系

3．5 小鼠接种EV71疫苗后MNC中TLR4、7、9表达水平的变化

3．6 TLR4、9基因敲除小鼠接种EV71疫苗后血清内中和抗体水平

第四章 讨论

4．1 小鼠TLR4、7、9 Real-time PCR方法方便、准确

4．2 疫苗接种后血清中中和抗体水平动态

4．3 TLR4、7、9在三家疫苗免疫应答中起到不同的作用

第五章 结论

参考文献

致谢

攻读硕士学位期间的研究成果

声明