持久饥饿对日本三角涡虫细胞形态结构、生化代谢和基因表达的影响

摘要

淡水涡虫是一类非常独特的动物，具有极强的耐饥饿能力。一条成体涡虫饥饿数月后仍能存活，除个体大小变化外，机体仍能保持正常的生理功能。关于饥饿对涡虫细胞形态、代谢变化和基因表达的影响国外研究较少，国内未见报道。本文以日本三角涡虫（Dugesia japonica）为材料，研究了持久饥饿对日本三角涡虫细胞形态结构、生化代谢和基因表达的影响，其中，利用HE染色和透射电镜技术观察了持久饥饿过程中日本三角涡虫细胞形态学变化;利用全自动生化分析仪检测了一些酶的活性变化;利用差异显示RT-PCR和差异蛋白质组学技术分析了饥饿诱导上调表达的基因和蛋白质;利用RACE技术克隆了DjHSP90/DjGRP78/DjHSP40 cDNA全长序列;利用实时荧光定量PCR技术检测了持久饥饿过程中DjHSP90/DjGRP78/DjHSP40基因的表达变化;利用整体免疫组化技术研究了DjHSP70和DjHSP90的组织分布;利用比色法研究了饥饿诱导的氧化和抗氧化损伤反应。结果报道如下:
　　1.持久饥饿过程中日本三角涡虫组织结构和细胞形态学变化
　　正常涡虫组织结构非常完整，组织间界限清晰。饥饿虫体组织间界限模糊，肠道组织和实质组织中出现大量嗜酸性细胞。非常明显的是，这些嗜酸性细胞经历一个称之为“细胞自溶”的过程，细胞质解体形成无数小泡。超微结构结果表明:一些细胞的细胞核呈空洞状，常染色质被吸收，仅留少量的异染色质;部分细胞仅保留少量的细胞质，细胞质中充满空泡，类似“自噬性细胞死亡”。选择性细胞死亡可能为涡虫在持久饥饿过程中存活提供了营养物质。
　　2.持久饥饿过程中日本三角涡虫体内6种酶活性和PCNA mRNA表达水平的变化
　　结果表明:饥饿过程中丙氨酸氨基转移酶(ALT)和天冬氨酸氨基转移酶(AST)的活性显著升高，是对照水平的10倍以上，涡虫再喂食后又降低到正常水平。正常个体中肌酸激酶(CK)和乳酸脱氢酶(LDH)的活性很强（分别达到250U/g蛋白质和80U/g蛋白质），饥饿4-6周活性显著下降，涡虫再喂食后又恢复到正常水平。饥饿过程中碱性磷酸酶(ALP)活性降低，而酸性磷酸酶(ACP)的活性升高。受饥饿影响，～140kD和～40kD蛋白水解酶活性显著增强。饥饿过程中PCNA mRNA的表达水平没有明显变化，说明饥饿对涡虫干细胞的影响较小。
　　3.差异RT-PCR和差异蛋白质组学技术筛选饥饿诱导日本三角涡虫上调表达的基因和蛋白质
　　克隆和测序了一些受饥饿诱导上调表达的cDNA片段，发现了一些有价值的EST序列，这些EST序列涉及细胞代谢、细胞死亡、细胞应激、蛋白质水解酶、RNA结合蛋白、转录因子和细胞骨架类蛋白。实时荧光定量PCR结果表明:DjHSP70、DjHSP90、DjHSP40和DjClg3A基因上调表达，而DjGRP78基因转录水平没有明显变化。
　　利用2-D电泳技术分离正常和饥饿涡虫组织差异表达的蛋白质质点，在饥饿涡虫组织中分离出2000个质点，差异质点超过1000个。质谱分析和NCBI数据库检索结果提示:部分上调表达的质点分别归属于细胞应激类、干细胞相关类、蛋白激酶类、膜泡运输类、抗氧化性蛋白类、受体类、转录因子类、细胞代谢类、表观遗传修饰类、细胞死亡相关蛋白类和RNA结合蛋白类。其中，表达水平超过2-倍的蛋白质分别是HSP70/90、Piwi-1蛋白、Vasa相关蛋白、Nanos相关蛋白、非受体丝/苏氨酸激酶、非受体酪氨酸激酶和受体酪氨酸激酶、突触相关蛋白、肌球蛋白重链、抗氧化酶6、细胞色素P450、SOD、G蛋白偶联的受体激酶、HMG蛋白、氨肽酶、U62家族肽酶蛋白、丝氨酸蛋白水解酶、磷酸丙糖异构酶、磷酸甘油酸激酶、Caspase7、ATG11和ATG4B。该工作为进一步研究上调表达基因和蛋白质的功能奠定了良好的基础。
　　4.持久饥饿诱导日本三角涡虫氧化和抗氧化性损伤反应
　　持久饥饿对脂质过氧化的影响采用丙二醛(MDA)水平进行评估。结果表明，涡虫饥饿30天后，MDA水平升高1.7倍，饥饿60天升高2倍，饥饿90天升高4倍。饥饿30天后抗氧化酶SOD活性升高50％，饥饿60天升高76％，饥饿90天升高123％。饥饿30天后CAT活性升高10％，饥饿60-90天后升高20％。结果表明:持久饥饿导致氧化性损伤，抗氧化酶SOD和CAT活性提高能保护细胞免受损伤。
　　5.日本三角涡虫DjHSP90、DjGRP78和DjHSP40基因克隆及生物信息学分析
　　DjHSP90cDNA全长2354bp，包含2148bp的开放阅读框(ORF)，编码715个氨基酸，氨基酸序列上含有HSP90蛋白家族的5个标签序列。ORF区DNA测序表明，DjHSP90基因结构区仅含有1个48bp内含子。HSP90系统发生树的基部是单细胞酵母，依次是植物、腔肠动物、扁形动物、软体动物、节肢动物和脊椎动物。HSP90系统发生树所体现的动物之间的亲缘关系与传统动物学分类相一致。
　　DjGRP78 cDNA全长2121bp，包含1983bp的开放阅读框（ORF），编码660个氨基酸，氨基酸序列上含有HSP70蛋白家族的3个标签序列。DjGRP78N-端氨基酸含有信号肽，C-端含有KTEL基序，说明该蛋白定位于内质网。ORF区DNA测序表明，DjGRP78基因结构区仅含有1个44bp内含子。GRP78系统发生树显示节肢动物、脊椎动物、腔肠动物和软体动物分别聚在一起，涡虫位于进化树的基部。GRP78系统发生树不能确定物种进化关系，但能反应出种属的特异性。
　　DjHSP40 cDNA全长1378bp，包含1236bp的开放阅读框，编码411个氨基酸，分子量46.2kDa，等电点是7.52。氨基酸序列分析表明:DjHSP40含有J、G/F、CR和C-末端4个结构域，说明它归属于Ⅰ型HSP40亚家族。HSP40系统发生树显示脊椎动物和节肢动物聚类在一起，与扁形动物形成姊妹分支。HSP40系统发生树与HSP90系统发生树和GRP78系统发生树显著不同，该现象说明涡虫应激蛋白在进化上产生分歧。
　　6.持久饥饿对日本三角涡虫DjHSP90、DjGRP78和DjHSP40基因表达的影响
　　应用荧光实时定量PCR技术研究持久饥饿对DjHSP90、DjGRP78和DjHSP40基因表达的影响。结果表明，饥饿30天涡虫DjHSP90转录水平升高1.5倍，饥饿45-60天维持在1.6倍，饥饿90天达到2倍，再喂食后没有恢复到正常水平。饥饿30天后DjGRP78的转录水平没有增加，饥饿60-90天甚至略低于正常水平（分别是0.65和0.69倍），再喂食后恢复到正常水平。饥饿30天涡虫DjHSP40转录水平升高1.6倍，饥饿60-90天分别是2倍和2.6倍，饥饿90天略有降低但仍高于对照水平（2倍）。再喂食后DjHSP40的转录水平非但没有降低，却高于对照水平3倍。
　　7.持久饥饿对日本三角涡虫DjHSP90和DjHSP70蛋白表达模式的影响
　　整体免疫组化显示，DjHSP90阳性信号在饥饿1月涡虫的背部两侧平行分布，对照虫体没有检测到阳性信号。DjHSP90的表达模式非常类似于涡虫精巢特异性基因DeY1的表达模式，提示DjHSP90阳性细胞很可能是精巢组织。DjHSP90上调表达可能保护精巢免受饥饿诱导的损伤。除涡虫头部和咽外，DjHSP70阳性细胞通体分布。此外，持久饥饿没有改变DjHSP70表达部位，但显著提高其表达水平。令人感兴趣的是，DjHSP70阳性细胞的特征非常类似于文献描述的涡虫干细胞(neoblasts)。由此推断，DjHSP70上调表达可能在维持涡虫干细胞稳态和保护干细胞免受饥饿诱导的损伤方面发挥重要作用。
　　结论:
　　1.持久饥饿严重损伤涡虫组织和细胞结构，导致选择性细胞死亡，细胞死亡可能为涡虫在持久饥饿过程中存活提供营养物质。
　　2.持久饥饿导致氧化性损伤，氧化性损伤可能是涡虫细胞死亡的主要诱因。
　　3.为抵御饥饿诱导的应激效应，HSP蛋白上调表达能保护涡虫免受伤害。特别是DjHSP70在维持涡虫干细胞稳态和保护干细胞免受饥饿诱导的损伤中发挥着重要作用。

目录

摘要

缩略语

1 前言

1．1 淡水涡虫简介

1．2 饥饿对涡虫组织结构、细胞形态和基因表达的影响

1．2．1 涡虫生长和退行生长

1．2．2 饥饿对涡虫组织结构和细胞形态的影响

1．2．3 饥饿对涡虫干细胞及干细胞相关基因表达的影响

1．3 饥饿生理学研究进展

1．3．1 饥饿对动物体重和组织器官结构的影响

1．3．2 饥饿对动物生理代谢的影响

1．4 饥饿诱导的细胞死亡方式及其分子机制

1．4．1 细胞自溶及其演变和发展

1．4．2 细胞自噬及其分子机制

1．4．3 饥饿诱导细胞凋亡的分子机制

1．5 课题提出的意义和主要研究内容

2 材料与方法

2．1 实验动物及处理

2．2 主要仪器

2．2 主要试剂及配制

2．3 实验方法

2．3．1 石蜡切片制备和HE染色

2．3．2 透射电镜样品制备

2．3．3 蛋白质浓度的测定

2．3．4 SDS-PAGE电泳

2．3．5 Wrestem-blot

2．3．6 转氨酶、乳酸脱氢酶和肌酸激酶活性的测定

2．3．7 丙二醛含量、超氧化物歧化酶和过氧化氢酶活性的测定

2．3．8 磷酸酶活性电泳

2．3．9 蛋白水解酶活性电泳

2．3．10 总RNA提取和cDNA合成

2．3．11 半定量PCR检测PCNA mRNA的表达变化

2．3．12 基因组DNA提取

2．3．13 质粒DNA提取

2．3．14 JM109和BL21感受态细胞的制备

2．3．15 mRNA差异显示技术筛选饥饿诱导上调表达的ESTs

2．3．16 cDNA片段的纯化、克隆载体的连接及转化

2．3．17 双向电泳-差异蛋白质组学分析

2．3．18 DjHSP90 cDNA全长克隆

2．3．19 DjGRP78 cDNA全长克隆

2．3．20 DjHSP40 cDNA全长克隆

2．3．21 实时荧光定量PCR

2．3．22 DjHSP90抗血清制备

2．3．23 DjHSP70抗血清制备

2．3．24 免疫组化技术

2．3．25 细胞大小的测量

2．3．26 涡虫整体免疫组化技术

3 结果

3．1 持久饥饿对日本三角涡虫组织结构、细胞形态的影响

3．2 持久饥饿对日本三角涡虫体内6种酶活性的影响

3．2．1 持久饥饿对日本三角涡虫转氨酶活性的影响

3．2．2 持久饥饿对日本三角涡虫磷酸酶活性的影响

3．2．3 持久饥饿对日本三角涡虫蛋白水解酶活性的影响

3．2．4 持久饥饿对日本三角涡虫肌酸激酶和乳酸脱氢酶活性的影响

3．3 持久饥饿对日本三角涡虫干细胞标志基因PCNA表达的影响

3．4 持久饥饿诱导日本三角涡虫上调表达基因的筛选

3．5 持久饥饿诱导日本三角涡虫上调表达蛋白质的筛选

3．6 持久饥饿诱导日本三角涡虫氧化和抗氧化性损伤研究

3．7 日本三角涡虫DjHSP90／DjGRP78／DjHSP40基因克隆及表达模式

3．7．1 日本三角涡虫DjHSP90基因克隆及生物信息学分析

3．7．2 日本三角涡虫DjGRP78基因克隆及生物信息学分析

3．7．3 日本三角涡虫DjHSP40基因克隆及生物信息学分析

3．7．4 持久饥饿对DjHSP90、DjGRP78和DjHSP40基因表达的影晌

3．8 日本三角涡虫DjHSP90抗血清的制备及原位表达

3．8．1 DjHSP90 C-端多肽表达载体的构建与诱导表达

3．8．2 DjHSP90 C-端多肽融合蛋白的纯化结果

3．8．3 DjHSP90抗血清特异性检测结果

3．8．4 日本三角涡虫DjHSP90在饥饿涡虫体内的表达模式

3．9 日本三角涡虫DjHSP70抗血清的制备及原位表达

3．9．1 DjHSP70表达载体的构建

3．9．2 DjHSP70原核表达诱导条件优化

3．9．3 DjHSP70抗血清特异性检测结果

3．9．4 日本三角涡虫DjHSP70在饥饿涡虫体内的表达模式

4 讨论

4．1 持久饥饿对日本三角涡虫组织结构、细胞形态的影响分析

4．2 持久饥饿对日本三角涡虫生化代谢的影响分析

4．3 持久饥饿诱导日本三角涡虫氧化和抗氧化性损伤的影响分析

4．4 持久饥饿对日本三角涡虫干细胞相关基因表达的影响分析

4．5 持久饥饿诱导日本三角涡虫热休克蛋白表达的生理意义

4．6 持久饥饿、氧化性损伤、细胞死亡和细胞应激反应之间的关系

5 结论

参考文献

致谢

攻读博士学位期间参加的科研项目和取得的研究成果清单

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