从转录组和蛋白组水平研究蝾螈肢体再生中细胞分化的途径和方式

摘要

蝾螈具有很强的再生能力。当在蝾螈右前肢上部的下1/3处切断后1-2d，创口周边的表皮细胞向创口表面迁移，覆盖创口形成单细胞层表皮，再通过细胞增殖形成顶端外胚层帽(apical ectodermalcap)。在随后的几天里，顶端外胚层帽下软骨细胞、肌细胞、神经髓鞘细胞等发生去分化作用而成为间充质细胞，构成再生胚基(regeneration blastema)。断肢后7d，伤口由上皮覆盖，完全愈合，局部已有枝芽形成。断肢后14d，未分化的间充质细胞进一步增殖分化。断肢后21d表皮逐渐增厚。断肢后28d，软骨形成。断肢后63d，形成比较完整的再生肢体。由上可见，细胞分化是蝾螈肢体再生的关键所在，其过程涉及多种基因/蛋白，了解其调节途径和方式，是揭示机理的必要环节。为此，建立蝾螈肢体再生模型，用大鼠全基因组基因表达谱芯片RatGenome 230 2.0定性、定量分析蝾螈右前肢切除后0h、2h、8h、1d、2d、4d、5d、6d、12d、20d和28d再生肢体的基因种类和表达丰度，并根据基因表达丰度计算ratio值，发现6742个基因的ratio值大于对照三倍，1956个基因的ratio值小于对照三倍，362个基因在有的时间点上调/有的时间点下调，三项合计9063个基因。用荧光差异双向电泳(DIGE)结合质谱(MS)检测定性、定量蛋白质种类和表达丰度，根据蛋白表达丰度计算ratio值，发现1331种蛋白的ratio值大于对照两倍，119种蛋白的ratio值小于对照两倍，39种蛋白在有的时间点上调/有的时间点下调，三项合计1489种蛋白。查GO注释表明，这些基因/蛋白涉及信号传导、细胞分化等33种生理活动。其中，560个基因和44种蛋白参与细胞分化信号通路构成，1985个基因和353种蛋白参与细胞分化。最后，用网络原理和方法解析基因/蛋白表达变化预示的生理活动(Ep(t)值)发现，蝾螈肢体再生中BCC、CRH、CXCR4、GnRH、GPCR和IL-1等6条通路的信号传导活动（Ep(t)值）显著强于对照，其调节的皮肤、肌肉、神经、软骨和骨细胞分化活动也于相应时间显著强于对照，表明这些信号通路促进细胞分化和皮肤、肌肉、神经、软骨与骨重建。综上所述，采用生物高通量技术检测蝾螈肢体再生中相关基因/蛋白的表达丰度，生物信息学和系统生物学方法分析了蝾螈肢体再生中相关基因/蛋白及其表达变化预示的生理活动强弱，网络分析方法分析了蝾螈肢体再生中基因/蛋白的作用机理，为进一步探讨蝾螈肢体再生机理提供了资料。

目录

摘要

缩略语表

第一章 文献综述：蝾螈肢体再生研究

1 蝾螈肢体再生

2 蝾螈肢体再生模型

3 蝾螈肢体再生的细胞来源

4 蝾螈肢体再生的过程

5 蝾螈肢体再生的基因组学研究

6 蝾螈肢体再生的蛋白质组学研究

7 信号通路对蝾螈肢体再生的调节作用

8 本论文的研究目的和意义

9 本论文的研究方案

参考文献

第二章 从基因转录组水平解析蝾螈肢体再生中皮肤、肌肉、神经、软骨和骨重建的途径和方式

摘要

引言

1 材料与方法

1．1 蝾螈肢体再生模型制备

1．2 Rat Genome 230 2．0芯片检测及数据整理

1．3 细胞分化相关基因的确认

1．4 细胞分化相关信号通路的确认

1．5 信号传导活动与细胞分化活动强弱的确认

1．6 信号传导活动与细胞分化活动的相关性分析

2 结果与分析

2．1 蝾螈肢体再生中有意义表达变化基因及其参与的生理活动

2．2 蝾螈肢体再生中皮肤细胞分化与皮肤重建

2．3 蝾螈肢体再生中肌肉细胞分化与肌肉重建

2．4 蝾螈肢体再生中神经细胞分化与神经重建

2．5 蝾螈肢体再生中软骨细胞分化与软骨重建

2．6 蝾螈肢体再生中骨细胞分化与骨重建

3 讨论

参考文献

第三章 从蛋白质组水平解析蝾螈肢体再生中皮肤、肌肉、神经、软骨和骨重建的途径和方式

摘要

引言

1 材料与方法

1．1 已述及的材料与方法

1．2 蝾螈再生肢体的蛋白抽提

1．3 蛋白双向电泳(IEF／SDS-PAGE，2D)

1．4 荧光标记差异蛋白双向电泳(DIGE)与灰度扫描定量

1．5 蛋白的质谱测序和定性

1．6 细胞分化相关蛋白的确认

1．7 细胞分化相关信号通路的确认

1．8 信号传导活动与细胞分化活动强弱的确认

1．9 信号传导活动与细胞分化活动的相关性分析

2 结果与分析

2．1 蝾螈肢体再生中有意义表达变化蛋白及其参与的生理活动

2．2 蝾螈肢体再生中皮肤细胞分化与皮肤重建

2．3 蝾螈肢体再生中肌肉细胞分化与肌肉重建

2．4 蝾螈肢体再生中神经细胞分化与神经重建

2．5 蝾螈肢体再生中软骨细胞分化与软骨重建

2．6 蝾螈肢体再生中骨细胞分化与骨重建

3 讨论

参考文献

第四章 蝾螈肢体再生中细胞分化相关基因表达与蛋白表达的相关性

摘要

引言

1材料与方法

1．1 已述及的材料与方法

1．2 蛋白表达的转录水平调控与翻译水平调控确认

2 结果与分析

2．1 蝾螈肢体再生中基因转录与蛋白表达的相关性

2．2 蝾螈肢体再生中基因转录与蛋白表达预示的生理活动相关性

2．3 蝾螈肢体再生中基因和蛋白的表达模式相关性

2．4 蝾螈肢体再生中基因和蛋白的聚类结果相关性

2．5 蝾螈肢体再生中细胞分化相关基因和蛋白的表达模式相关性

2．6 蝾螈肢体再生中细胞分化相关基因和蛋白的聚类结果相关性

2．7 蝾螈肢体再生中基因表达变化与蛋白表达变化预示的细胞分化信号通路的信号传导活动相关性

2．8 蝾螈肢体再生中基因表达变化与蛋白表达变化预示的细胞分化活动相关性

2．9 蝾螈肢体再生中基因表达变化与蛋白表达变化预示的信号通路对细胞分化的调节作用相关性

3 讨论

参考文献

总结与结论

1 总结

2 结论

致谢

攻读硕士学位期间参加的科研项目和发表论文

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