白鲢p38 MAPK,C-fos,C-jun基因克隆及其微囊藻毒素暴露后的表达分析

摘要

丝裂原活化蛋白激酶（MAPKs）是细胞内重要的信号转导分子，参与生物体多种生理和病理过程的调节。p38 MAPK是MAPK通路的重要成员之一，它可被细胞内生长因子、细胞因子和胞外多种刺激（环境压力、紫外线、放射线、热休克、炎症因子、特定抗原等）所活化，并参与细胞内多种信号传递过程。
　　原癌基因c-fos、c-jun、c-myc属即刻早期基因(Immediately Early Genes，IEGs)成员。目前已发现的IEGs有十几种，其中c-fos、c-jun基因被广泛用作外界刺激后神经元活化的标记，在细胞活动中起着重要的调控作用。
　　本研究首次克隆了白鲢肝脏p38 MAPK、c-fos和c-jun基因cDNA全长并进行了序列分析，同时检测了微囊藻毒素(Microcystins，MC)对白鲢的急性毒性作用及其腹腔注射染毒后白鲢肝脏和肾脏p38 MAPK、c-fos、c-jun和c-myc的表达分析。
　　本研究利用RT-PCR和RACE技术扩增得到p38 MAPK、c-fos、c-jun基因的cDNA全序列。序列分析结果表明，白鲢肝脏p38 MAPK基因序列全长2418 bp，开放阅读框1086 bp，编码361个氨基酸;c-fos基因序列全长为1719 bp，开放阅读框1059 bp，编码352个氨基酸;c-jun cDNA全长1931 bp，开放阅读框927 bp，编码308个氨基酸。生物信息学分析发现，白鲢p38 MAPK蛋白相对分子质量为41.64 kD，理论等电点为5.54，该蛋白是一个不稳定蛋白，具有较强的亲水性。c-Fos蛋白相对分子质量为38.242 kD，理论等电点为4.93，该蛋白是一个不稳定蛋白且具有较强的亲水性。c-Jun蛋白相对分子质量为33.928 kD，理论等电点为9.08，是一个不稳定蛋白且具有一定的亲水性。二级结构预测显示，p38 MAPK包含45.71％α-螺旋、13.02％的延伸链、4.99％的β-折叠和36.29％的无规则卷曲;c-Fos包含25.85％的α-螺旋、12.78％的延伸链、1.42％的β-折叠和59.94％的无规则卷曲;c-Jun包含32.14％的α-螺旋、5.52％的延伸链、1.62％的β-折叠和60.71％的无规则卷曲。
　　对其功能结构位点分析发现，p38 MAPK在35～309 aa之间存在一个保守的丝氨酸/苏氨酸激酶区;c-Fos和c-Jun分别在108～172 aa和227～291 aa处有一个典型的亮氨酸拉链结构。通过构建氨基酸系统发育树显示，白鲢p38 MAPK与鲤鱼同源性高达96％，白鲢c-Fos与草鱼c-Fos同源性高达97％，白鲢c-Jun与草鱼c-Jun同源性高达95％，与哺乳动物同源性相对较低。
　　另外，qPCR检测结果显示p38 MAPK、c-fos和c-jun在白鲢各个组织均有表达，其中p38 MAPK表达量高低依次是肌肉＞肠＞脾＞肾＞鳃＞肝＞心＞脑;c-fos表达量高低依次是肝＞脾＞肾＞肠＞肌肉＞鳃＞脑＞心;c-jun表达量高低依次是肝＞肠＞心＞脑＞脾＞肾＞肌肉＞鳃。
　　通过上下增减剂量法(up and down procedure，UDP)对白鲢进行MC急性毒性实验，结果显示，MC对白鲢48 h LDs0为520μg·Kg-1。根据半致死剂量选取50和200μg·Kg-1浓度组MC腹腔注射暴露白鲢，分别于1、3、8和12h后取材白鲢肝、肾组织，提取RNA，通过qPCR检测白鲢p38 MAPK、c-fos、c-jun和c-myc基因的表达变化，结果表明，MC对其表达都有明显的诱导作用，推测白鲢p38 MAPK、c-fos、c-jun和c-myc可能与MC肝毒性和肾毒性相关。
　　本研究发现，MC可激活白鲢肝脏p38 MAPK通路及其下游原癌基因c-fos、c-jun、c-myc，推测MC诱发肝炎/肝癌可能通过该信号通路介导。该研究结果为深入研究MC诱发肝炎、肝癌的分子机制，寻找MC毒作用新的分子靶点和肝病防治药物靶点提供理论依据。

目录

摘要

缩略语

第一章 绪论

1．1 p38 MAPK基因概述

1．2 即刻早期基因c-fos、c-jun、c-myc概述

1．2．1 c-fos基因概况

1．2．2 c-jun研究概况

1．2．3 c-myc研究概况

1．3 p38MAPK、c-fos、c-jun和c-myc表达调控

1．4 p38MAPK、c-fos、c-jun和c-myc在鱼类中的研究

1．5 MC概述

1．5．1 MC的结构及理化性质

1．6 MC的毒性

1．6．1 MC的肝毒性

1．6．2 MC的肾毒性

1．6．3 MC肝毒性机理

1．7 RACE技术简介

1．7．1 3’RACE技术原理

1．7．2 5’RACE技术原理

1．8 本研究目的与意义

第二章 材料与方法

2．1 实验材料

2．1．1 实验动物及微囊藻毒素

2．1．2 载体

2．1．3 引物

2．1．4 主要试剂

2．1．5 本研究常用试剂配制

2．2 实验方法

2．2．1 总RNA的制备

2．2．2 p38MAPK、c-fos和c-jun基因cDNA序列的克隆、测序与分析

2．2．3 白鲢p38MAPK、c-fos、c-jun基因3’末端扩增

2．2．4 白鲢p38MAPK、c-fos和c-jun基因5’末端扩增

2．2．5 p38MAPK、c-fos和c-jun基因在白鲢不同组织中的特异性表达

2．2．6 白鲢p38MAPK、c-fos和c-jun基因的生物信息学分析

2．2．7 MC对白鲢LD50的测定

2．2．8 MC暴露对白鲢肝、肾p38 MAPK、c-fos、c-jun和c-myc表达的影响

2．2．9 荧光定量PCR

2．3 数据结果分析

第三章 实验结果与分析

3．1 白鲢肝脏总RNA提取与检测

3．2 白鲢p38 MAPK基因克隆及序列分析

3．2．1 白鲢p38 MAPK基因保守序列及RACE末端克隆

3．2．2 白鲢p38 MAPK基因全序列及其编码氨基酸序列

3．2．3 白鲢p38 MAPK氨基酸序列同源性及系统进化分析

3．2．4 白鲢p38 MAPK基因生物信息学分析

3．2．5 白鲢p38 MAPK基因在不同组织中的差异性表达

3．3 白鲢c-fos基因克隆及序列分析

3．3．1 白鲢c-fos基因核心序列及RACE末端

3．3．2 白鲢c-fos基因全序列

3．3．3 白鲢c-Fos氨基酸序列同源性及系统进化分析

3．3．4 白鲢c-fos基因生物信息学分析

3．3．5 白鲢c-fos基因在不同组织中的差异性表达

3．4 白鲢c-jun基因克隆及序列分析

3．4．1 白鲢c-jun基因核心序列及RACE末端

3．4．2 白鲢c-jun基因全序列

3．4．3 白鲢c-Jun氨基酸序列同源性和系统进化分析

3．4．4 白鲢c-jun生物信息学分析

3．4．5 白鲢c-jun基因在不同组织中的差异性表达

3．5 MC对白鲢的急性毒性实验

3．6 MC急性染毒白鲢肝、肾中p38 MAPK、c-fos、c-jun和c-myc的表达变化

3．6．1 MC对白鲢肝脏p38 MAPK、c-fos、c-jun和c-myc基因表达水平的影响

3．6．2 MC对白鲢肾脏p38 MAPK、c-fos、c-jun和c-myc基因表达水平的影响

第四章 讨论

4．1 白鲢p38 MAPK序列分析及其组成型表达

4．2 白鲢c-fos基因序列分析及其组织表达

4．3 白鲢c-jun基因克隆及其序列分析

4．4 MC对白鲢的急性毒性

4．5 MC染毒后白鲢肝、肾p38 MAPK、c-fos、c-jun和c-myc的表达变化

结论与展望

本研究创新点

参考文献

致谢

攻读硕士学位期间学术成果

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