微囊藻毒素LR对大鼠睾丸支持细胞c-jun、c-fos基因表达的影响及机制研究

摘要

背景与目的：
　　微囊藻毒素(mircrocystins，MCs)是由水体中蓝藻类所产生的具有生物活性的单环七肽化合物，具有多种同分异构体，MC-LR是微囊藻毒素中毒性最强的一种。目前蓝藻毒素家族中唯有微囊藻毒素被世界卫生组织(WHO)评估为国际性的健康危险因素，它广泛分布在淡水湖泊及池塘水库中，能导致急性肝损伤并且是活跃的促肿瘤因子，已经被国内外广泛研究。肝肾是其主要的靶器官，目前，MCs引起的生殖毒性的研究报道还很少，且主要是引起一些形态学及激素水平的改变。从细胞及基因水平研究MC-LR对雄性生殖器官的毒作用和机制的报道鲜有见到。本实验拟通过用MC-LR染毒原代SD大鼠睾丸支持细胞，探讨MC-LR对大鼠睾丸支持细胞的毒性作用及对细胞即刻早期应答基因c-fos、c-jun基因和蛋白表达的影响，阐明MC-LR对支持细胞毒性作用可能的原理及机制。
　　方法：
　　在体外分离培养大鼠睾丸支持细胞，并用免疫荧光进行鉴定。设置微囊藻毒素-LR药物组(0.5nM，5nM，50nM，500nM)和对照组(0nM)作用于原代支持细胞。通过分别用MC-LR作用于原代支持细胞24h和48h后MTT法测定细胞增殖的情况确定合适的作用时间和有效作用浓度；用FCM法测定细胞的凋亡；用RT-PCR法检测c-jun、c-fos mRNA表达；用Western-blot方法检测c-jun、c-fos的蛋白表达。从而从细胞和基因水平分析MC-LR对大鼠睾丸支持细胞毒性作用及对c-jun、C-fosmRNA及蛋白表达的影响。
　　结果：
　　实验结果显示，在MTT法中，微囊藻毒素-LR作用于睾丸支持细胞24h和48h后分别检测发现：作用24h时，低剂量组(0.5nM，5nM)与对照组(0nM)相比其活性无明显变化，而高剂量组(50nM，500nM)的活性明显下降，增殖减慢，且变化具有统计学意义(P<0.05)；作用48h时，低剂量组(0.5nM，5nM)与对照组(0nM)相比其活性无明显变化，而高剂量组(50nM，500nM)的活性显著下降，变化具有统计学意义且500 nM组差异有更显著的变化(P<0.01)。遂选用高剂量组和对照组作为后续实验的作用时间，48h为作用浓度进行后续的实验。流式细胞术(FCM)检测结果发现高剂量组微囊藻毒素-LR能够引起明显的细胞凋亡，有统计学意义(P<0.05)，低剂量组变化则不显著。RT-PCR法检测结果显示，高剂量组的支持细胞出现c-jun、c-fos基因表达上调，具有统计学意义。Western-blot方法检测到c-jun、c-fos蛋白表达上调，上调结果具统计学意义。
　　结论：
　　微囊藻作用于SD大鼠原代支持细胞后引起支持细胞的增殖抑制和细胞凋亡；刺激了c-fos和c-jun基因和蛋白的表达上调，推测c-fos和c-jun表达上调改变转录调节通路而引起支持细胞增殖抑制和促进凋亡，最终导致生殖发育损伤。