百草枯对人肝HepG2细胞的毒理学研究

摘要

百草枯(PQ)是一种水溶型除草剂，因其易于被土壤吸附、在环境中残留量相对较低和具有良好的除草效果，PQ先后在全球120多个国家被广泛使用。但自1962年注册生产以来，PQ已经引起了严重的公共健康问题，由 PQ导致的自杀、谋杀、误服以及生产和使用接触的中毒死亡事件时有报道，而PQ的毒性机制至今仍不清楚，目前针对PQ中毒也没有的良好治疗策略和高效解毒剂。
　　通过对PQ中毒病人、死者和动物进行研究，人们发现体内蓄积的PQ主要存在于肺，而肾作为水溶物质的排泄器官，其在PQ中毒之后发生的变化也被大量调查。此外，近年来的慢性毒性实验发现，PQ引起的部分病理特征与一些早老疾病症状相似，随之PQ的神经毒性也引起了人们的广泛关注。但PQ中毒对人肝的影响一直未被深入探讨。
　　众所周知，肝是机体最重要的解毒器官，在外源毒物的降解过程中发挥着举足轻重的作用，因此解明肝在PQ处理后发生的变化对全面理解PQ的毒性效应及机制具有重要意义，也有利于寻找新的方法提高肝对PQ的抵抗力、增强肝对PQ中毒的消解作用。人肝癌细胞 HepG2具有肝细胞的多种代谢和转化酶系，是良好的肝细胞研究模型，故本文以 HepG2细胞作为实验材料，运用一系列细胞和分子生物学新技术开展研究，探讨PQ对HepG2细胞的毒性效应及可能机制。
　　首先，本研究从细胞水平上，采用6种方法，选择存活力、生长状况、周期、凋亡和突变5个指标评估了PQ处理24 h对HepG2细胞的毒性效应。其中，MTT实验结果显示PQ对HepG2细胞存活力的24 h-IC50为51.17 mg/L，显微观察发现7.21 mg/L的PQ即可导致细胞的形态结构发生病理性改变、贴壁能力下降、生长受到抑制，BrdU和PI双色流式实验检测到23.36 mg/L的PQ即可导致细胞周期停滞(S期细胞减少、G1和G2期细胞增多)，annexin V和PI双色流式实验检测到7.21 mg/L的PQ即可诱导细胞凋亡，微核(MN)和姊妹染色单体交换(SCE)实验结果表明7.21 mg/L的PQ可导致HepG2细胞的突变率大大提高，HepG2细胞发生的这些毒性效应的程度均与PQ处理浓度呈正相关。此外，本研究在MN实验操作之前对HepG2细胞进行了低渗处理，结果提高了MN图像的分辨力，这对于增加同类细胞MN实验的准确率和效率均具有重要意义。
　　随后，本研究从分子水平上，调查了PQ处理24 h对HepG2细胞基因组DNA稳定性的影响，以分析PQ对HepG2细胞毒性效应的可能机制。单细胞凝胶电泳、随机扩增多态性和高效液相色谱(HPLC)实验结果显示，PQ可导致HepG2细胞发生明显的基因组DNA断裂损伤、多态性下降和甲基化升高，且基因组的这些变化与PQ处理浓度呈正相关。定量PCR和免疫印迹实验的结果表明，HepG2细胞内抑制断裂双链DNA(dsDNA)进行同源重组(HR)修复的细胞因子BLM和DNA ligase I的表达量随PQ处理浓度增大而减少，即PQ处理后HR修复增强，这表明HepG2细胞对PQ导致的基因组不稳定有明显的应激反应，该反应也合理地解释了PQ导致的SCE频率增高；而HepG2细胞内促进断裂dsDNA进行非同源末端连接(NHEJ)修复的细胞因子Ku70的表达量随PQ处理浓度增大呈先增多后减少变化，NHEJ修复的先增强显然也是HepG2细胞对PQ导致基因组不稳定性产生的应激反应，但后减弱则意味着NHEJ修复最终走向崩溃，难以挽救PQ导致的基因组不稳定。
　　进一步，采用流式细胞术、HPLC和 ELISA等方法系统评价了 PQ处理后 HepG2细胞发生的氧化应激反应和氧化损伤。结果显示，低浓度PQ处理组HepG2细胞超氧化物歧化酶和过氧化氢酶活力有所提高，所有PQ处理组HepG2细胞内氧化型谷胱甘肽含量均增多，表明 HepG2细胞对 PQ导致的氧化损伤产生了应激反应；但同时发现所有PQ处理组HepG2细胞内活性氧和丙二醛含量均较多，表明氧化应激反应不足以平衡氧化损伤；因此同时检测到PQ处理组DNA氧化产物8-羟基脱氧鸟苷的含量明显多于正常组。DNA发生氧化损伤可能正是PQ导致HepG2细胞基因组不稳定的直接原因。
　　最后，采用火焰原子吸收法检测到PQ处理导致HepG2细胞内Ca、Mg和Zn含量失衡。其中，Ca的含量增加可能是Ca活化途径介导细胞凋亡的体现，不利于细胞存活；Mg含量的减少则会阻滞细胞生长和分裂，同时不利于基因组的稳定；而Zn含量的减少不仅会促进细胞凋亡，而且不利于基因组稳定性的维持和DNA氧化损伤的防止。
　　综上所述，PQ处理可能首先导致HepG2细胞发生了严重的DNA氧化损伤和Ca、Mg及Zn含量的失衡，进而引起基因组稳定性下降，最终抑制了细胞的正常存活、生长和增殖，诱导细胞发生凋亡或突变。尽管HepG2细胞对PQ刺激表现出一定程度的DSB修复增强和抗氧化应激，但不足以解除PQ的细胞毒性。

目录

缩略词表

第一章 引言

1.1 PQ使用概述

1.2 PQ对动物和人的毒性及其机理

1.3 HepG2细胞的应用

1.4本研究涉及的细胞和分子毒理学技术

1.5 本研究的背景、目的和意义

1.6 本研究的技术路线和研究内容

第二章 PQ对HepG2细胞的毒性效应

2.1材料

2.2方法

2.3 结果

2.4 讨论

第三章 PQ对HepG2细胞基因组DNA稳定性的影响

3.1 材料

3.2方法

3.3 结果

3.4 讨论

第四章HepG2细胞对PQ的氧化应激及其DNA的氧化损伤

4.1 材料

4. 2方法

4.3 结果

4.4 讨论

第五章 PQ对HepG2细胞Ca、Mg和Zn含量的影响

5.1 材料

5.2 方法

5.3 结果

5.4 讨论

结论与展望

结论

展望

本研究创新点

参考文献

致谢

攻读博士学位期间研究成果

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