盅口属和冠环属线虫的分类及亲缘关系分析

摘要

感染马属动物的寄生线虫不仅数量巨大，而且种类繁多。尤其是圆线亚科(Strongylinae)与盅口亚科(Cyathostominae)圆线虫严重危害马属动物的健康，给畜牧业和养殖业带来困扰和损失。虽然驱虫药能够防治圆线虫病，但这种手段已经导致盅口亚科线虫产生抗药性，使患病率增加，改变了宿主体内的寄生虫种群结构。所以，提出新型的综合性控制方法显得尤为重要。然而，关于马属动物寄生线虫的基础生物学和系统发育学方面的知识十分有限，主要是因为依据形态学鉴定种类和诊断有一定的局限性。本研究采用经典分类与分子分类相结合的方法对盅口亚科盅口属（Cyathostomum）和冠环属（Coronocyclus）线虫的分类和系统发育关系进行分析，首次描述了3种冠环属线虫的扫描电镜结构，然后测定和分析两个属的ITS序列和部分cox1(pcox1)序列，并探讨和分析了他们的亲缘关系和分类地位。
　　通过对采自河南省驴肠道的3种冠环属线虫:冠状冠环线虫（Coronocycluscoronatus）、大唇片冠环线虫（C.labiatus）、小唇片冠环线虫（C.labratus）进行扫描电镜的观察，结果表明3种冠环线虫的体表形态特征差异明显，主要表现在外叶冠数目、亚中乳突起始部位、雄虫生殖锥背唇上附属物、雌虫尾部等方面。研究结果与之前学者们在光镜下观察的结果基本一致，相比之下，扫描电镜观察到的外部形态更清楚、更准确，提供了更多更具体的结构特征。本研究将冠环属线虫与盅口属的扫描电镜结构特征进行了比较，为两个属的分类提供更详细的形态学资料。
　　运用聚合酶链式反应(PCR)技术对3种盅口属线虫:四刺盅口线虫（Cyathostomumtetracanthum）、蝶状盅口线虫（C.pateratum）、碗形盅口线虫（C.catinatum）和3种冠环属线虫的rDNA-ITS序列进行测定和比对分析。结果显示:ITS（包括5.8S）序列长748-843bp，其中冠状冠环线虫的ITS2序列比其它种缺失约90bp，6个种的5.8S序列完全一致。ITS1+ITS2总变异位点154个（包括gap），简约信息位点64个。ITS1和ITS2的G+C含量分别为47.0％-48.6％和37.7％-41.1％。ITS2序列的差异性（0-31.9％）大于ITS1序列(0-4.9％)，ITS1和ITS2序列种间差异(1.1％-4.9％，1.2％-31.9％)明显大于种内差异(0-1.9％，0-0.9％)。而且，四刺盅口线虫与蝶状盅口线虫和碗形盅口线虫的差异性，大于四刺盅口线虫与3种冠环线虫之间的差异性。研究获得的盅口属和冠环属线虫的部分cox1序列均为393bp，无插入和缺失，A+T含量(65.9％-68.9％)明显高于G+C含量（31.1％-34.1％），显示出AT碱基偏倚性。通过比对pcox1序列发现，种间差异（6.6％-15.8％）大于种内差异(0.5％-2.5％)。以长伞杯冠线虫（Cylicostephanus longiburs）为外群，基于ITS1+ITS2序列和pcox1序列分别构建NJ和MP发育树，得到的拓扑结构基本相似。内群分为两大支，蝶状盅口线虫与碗形盅口线虫聚为一支，四刺盅口线虫与3种冠环属线虫聚为另一支。不同的是，基于ITS1+ITS2序列构建的系统发育树中，四刺盅口线虫总是与大唇片冠环线虫和小唇片冠环线虫聚在一起，而在基于pcox1序列构建的系统发育树中四刺盅口线虫与冠状冠环线虫聚为一支。研究结果表明四刺盅口线虫的分类地位与形态学分类不吻合，四刺盅口线虫与冠环属线虫的亲缘关系较近。

目录

摘要

1 引言

1．1 圆线虫概述

1．1．1 圆线虫的分类

1．1．2 圆线虫的危害

1．1．3 圆线虫的生活史

1．1．3 圆线虫的防治

1．2 扫描电镜技术在线虫分类研究中的应用

1．2．1 扫描电镜在生物学上的应用

1．2．2 扫描电镜在线虫分类上的应用

1．3 分子标记技术在线虫分类鉴定中的应用

1．3．1 rDNA-ITS分子标记在线虫研究中的应用

1．3．2 线粒体DNA(mtDNA)分子标记在线虫研究中的应用

1．4 本研究的内容及意义

2 材料与方法

2．1 实验材料

2．1．1 虫体标本采集与处理

2．1．2 主要试剂及设备

2．2 实验方法

2．2．1 形态学初步分类

2．2．2 虫体的扫描电镜观察

2．2．3 基因组DNA的提取

2．2．4 PCR扩增及产物鉴定

2．2．5 PCR产物纯化和测序

2．2．6 测序结果的分析比对

3 结果

3．1 扫描电镜观察结果

3．1．1 冠状冠环线虫

3．1．2 大唇片冠环线虫

3．1．3 小唇片冠环线虫

3．2 rDNA-ITS序列测定及系统发育分析结果

3．2．1 rDNA-ITS序列扩增结果

3．2．2 rDNA-ITS序列分析

3．2．3 盅口属线虫与冠环属线虫ITS1+ITS2序列遗传距离分析

3．2．4 基于ITS序列的系统发育分析

3．3 pcox1序列测定及系统发育分析结果

3．3．1 pcox1序列扩增结果

3．3．2 pcox1序列分析

3．3．2 pcox1序列遗传距离分析

3．3．3 基于pcox1序列的系统发育分析

4 讨论

5 结论

参考文献

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致谢

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