日本三角涡虫Runt-1、Runt-2和hnRNPA2B1基因的克隆及其表达分析

摘要

本文利用RACE技术、整体原位杂交技术、实时荧光定量PCR技术和生物信息学技术等，以日本三角涡虫（Dugesia japonica）为研究材料，克隆了与创伤及再生相关基因的全长cDNA序列并对其进行了生物信息学分析，同时对这些基因的表达情况进行了系统研究，结果如下:
　　1、利用RACE技术首次在日本三角涡虫中克隆了Dj Runt-1，DjRunt-2和DjhnRNPA2 B1三基因的全长cDNA序列，并根据三基因所推导的氨基酸序列用邻接法构建了系统进化树。DjRunt-1基因cDNA全长为1029bp，包含一个969bp最大开放阅读框(ORF)，编码一个由322个氨基酸残基组成的蛋白质;DjRunt-2基因cDNA全长为765bp，包含一个576bp最大开放阅读框(ORF)，编码一个由191个氨基酸残基组成的蚩白质;DjhnRNPA2B1基因cDNA全长为1142bp，包含一个825bp最大开放阅读框(ORF)，编码一个由274个氨基酸残基组成的蛋白质。系统进化分析表明三基因在进化进程中非常保守。
　　2、利用ExPASy，TMHMM2.0等在线软件对三基因所推导的氨基酸进行了生物信息学分析，结果表明: Dj Runt-1的分子量为37.55kDa，等电点9.59;DjRunt-2的分子量为21.55kDa，等电点9.36，二者都含有“RD”结构域;DjhnRNPA2B1的分子量为31.4kDa，等电点8.35，含有一个“RBD”结构域。三者均是亲水性核蛋白，存在多个磷酸化位点，无信号肽且都不存在跨膜区。
　　3、利用整体原位杂交和实时荧光定量PCR技术研究了DjRunt-1，DjRunt-2和DjhnRNPA2 B1三基因在成体及切割再生过程中的时空表达模式。结果显示:DjRunt-1基因在整体中广泛表达，在切割再生的胚基基部均有表达，而在再生的胚基部位没有表达;RT-PCR结果显示，Dj Runt-1基因在切割再生1和3灭上调表达并在1天达到峰值。DjRunt-2基因在整体中广泛表达，并且在切割再生的胚基及再生至5d后的胚基基部均有表达;RT-PCR结果显示，Dj Runt-2基因在切割后上调且在再生1天达到峰值，与DjRunt-1基因呈现相似的表达趋势。结果提示:两基因在涡虫受损后可能促进创面修复及诱导于细胞的增殖和分化。DjhnRNPA2B1基因在性未成熟个体和性成熟个体身体两侧即精巢部位均有表达，在各再生阶段的胚基部位均有表达，其中，再生3、5天杂交信号最强。RT-PCR结果显示，DjhnRNPA2 B1基因切割后0和5天上调表达并在0天达到峰值，结果提示DjhnRNPA2 B1基因受创伤信号诱导调控细胞增殖和分化，同时DjhnRNPA2B1基因可能是一个多功能基因，在涡虫体内参与了生殖系统和神经系统的发育。

目录

摘要

缩略语

第一章 前言

1．1 日本三角涡虫简介

1．2 日本三角涡虫再生研究进展

1．3 Runt-1、Runt-2基因研究进展

1．4 hnRNPA2B1基因及其研究进展

1．5 立题依据

第二章 材料与方法

2．1 材料

2．1．1 实验材料的采集及培养

2．1．2 实验仪器

2．1．3 实验试剂

2．1．4 实验所用引物

2．2 实验方法与步骤

2．2．1 日本三角涡虫RNA提取的前期准备

2．2．2 日本三角涡虫总RNA的提取

2．2．3 日本三角涡虫实时荧光定量PCR RNA的提取

2．2．4 RNA的测定

2．2．5 一般PCR扩增模板的制备

2．2．6 3’-RACE cDNA模板的制备

2．2．7 5’-RACE cDNA模板的制备

2．2．8 RT-PCR cDNA模板的制备

2．2．9 DjRunt-1、DjRunt-2和DjhnRNPA2B1基因的扩增

2．2．10 DjRunt-1、DjRunt-2和DjhnRNPA2B1基因的生物信息学分析

2．2．11 DjRunt-1和DjhnRNPA2B1基因原位杂交

2．2．12 DjRunt-1、DjRunt-2和DjhnRNPA2B1基因的RT-PCR

第三章 结果

3．1 日本三角涡虫总RNA的提取

3．1．1 总RNA的提取

3．1．2 RT-PCR RNA的提取

3．2 反转录模板cDNA的效价检测

3．3 DjRunt-1、DjRunt-2和DjhnRNPA2B1基因EST片段的扩增

3．3．1 DjRunt-1基因EST片段的扩增

3．3．2 DjRunt-2基因EST片段扩增结果

3．3．3 DjhnRNPA2B1基因EST片段扩增结果

3．4 DjRunt-1、DjRunt-2和DjhnRNPA2B1基因3’、5’的扩增

3．4．1 DjRunt-1基因3’、5’-RACE片段的扩增结果

3．4．2 DjRunt-2基因3’、5’-RACE片段扩增结果

3．4．3 DjhnRNPA2B1基因3’、5’-RACE片段扩增结果

3．5 DjRunt-1，DjRunt-2和DjhnRNPA2B1基因cDNA全长

3．5．1 DjRunt-1基因的拼接及分析

3．5．2 DjRunt-2基因的拼接及分析

3．5．3 DjhnRNPA2B1基因的拼接及分析

3．6 DjRunt-1、DjRunt-2和DjhnRNPA2B1基因的系统进化分析

3．6．1 DjRunt-1基因的系统进化分析

3．6．2 DjRunt-2基因的系统进化分析

3．6．3 DjRunt-1和DjRunt-2蛋白氨基酸序列的同源性比较

3．6．4 DjhnRNPA2B1基因的系统进化分析

3．7 DjRunt-1蛋白质结构及理化性质

3．7．1 DjRunt-1蛋白基本理化性质

3．7．2 DjRunt-1蛋白质信号肽的预测

3．7．3 DjRunt-1蛋白磷酸化位点预测

3．7．4 DjRunt-1蛋白核输出信号预测

3．7．5 DjRunt-1蛋白跨膜预测

3．7．6 DjRunt-1蛋白二级结构预测

3．7．7 DjRunt-1蛋白三级结构预测

3．8 DjRunt-2蛋白质理化性质

3．8．1 DjRunt-2蛋白基本理化性质

3．8．2 DjRunt-2蛋白质信号肽的预测

3．8．3 DjRunt-2蛋白磷酸化位点预测

3．8．4 DjRunt-2蛋白核输出信号预测

3．8．5 DjRunt-2蛋白跨膜预测

3．8．6 DjRunt-2蛋白二级结构预测

3．8．7 DiRunt-2蛋白三级结构预测

3．9 DjhnRNPA2B1蛋白质结构及理化性质

3．9．1 DjhnRNPA2B1蛋白基本理化性质

3．9．2 DjhnRNPA2B1蛋白质信号肽的预测

3．9．3 DjhnRNPA2B1蛋白磷酸化位点预测

3．9．4 DjhnRNPA2B1蛋白核输出信号预测

3．9．5 DjhnRNPA2B1蛋白跨膜预测

3．9．6 DjhnRNPA2B1蛋白二级结构预测

3．9．7 DjhnRNPA2B1蛋白三级结构预测

3．10 DjRunt-1、DjRunt-2和DjhnRNPA2B1基因的原位杂交结果

3．10．1 探针效价检测结果

3．10．2 DjRunt-1基因的整体原位杂交

3．10．3 DjRunt-2基因的整体原位杂交

3．10．4 DjhnRNPA2B1基因的整体原位杂交

3．11 DjRunt-1、DjRunt-2和DjhnRNPA2B1基因的RT-PCR结果

3．11．1 DjRunt-1基因的RT-PCR

3．11．2 DjRunt-2基因的RT-PCR

3．11．3 DjhnRNPA2B1基因的RT-PCR

第四章 讨论

4．1 DjRunt-1和DjRunt-2基因的表达分析

4．2 DjhnRNPA2B1基因的表达分析

第五章 结论

参考文献

致谢

攻读硕士学位期间发表的论文和参与的课题

声明