白细胞介素18(IL-18)调节大鼠肝细胞增殖的分子机制研究

摘要

肝脏是机体的重要器官，具有极强的再生能力。肝再生（liver regeneration, LR）过程受机体的精密调控，包括细胞因子和生长因子在内的多种功能蛋白参与，涉及多条信号通路的交互作用。白细胞介素18（interleukin18, IL-18）是一个多效性的细胞因子，除具较强的γ-干扰素诱生能力外，还可增强NK细胞毒性，刺激T细胞、成骨、生殖细胞等细胞增殖，刺激产生粒细胞巨噬细胞刺激因子，调节细胞间粘附因子等。然而，迄今为止，IL-18对肝细胞增殖的调节作用及其分子机制尚未见报道。本研究主要内容包括：
　　⑴用生物高通量检测技术结合生物信息学和系统生物学方法对IL-18在大鼠肝再生中对肝细胞增殖的作用进行了理论分析和功能预测。首先，根据GenMAPP、KEGG、QIAGEN等网站资料查找IL-18通路网络图并汇总通路相关基因。其次，根据TRED、Lymph TF-DB等网站资料查找通路中的转录因子调节的靶基因，这些靶基因再经NCBI网站上“Gene Ontology”筛选得到与细胞增殖相关的靶基因。然后，制备大鼠2/3肝切除模型（partial hepatectomy, PH），分离再生肝的肝细胞，用Rat Genome2302.0芯片检测上述基因在大鼠肝再生中的表达变化。最后，用谱函数Ep(t)分析它们的协同作用预示的生理活动。结果表明，IL-18信号通路包括NF-κB、p38/ATF2、JNK3条途径，涉及33个通路相关基因和受通路调节的395个靶基因。其中，13个通路相关基因和49个与细胞增殖相关的靶基因在大鼠肝再生中发生有意义的表达变化。此外，IL-18信号通路的信号转导活动与该通路调节的细胞增殖活动（Ep(t)值）于PH后12-72h显著高于对照组（P＜0.05）。其中，NF-κB途径和该途径调节的细胞增殖相关靶基因的基因协同值分别于PH后2-36h和6-72h显著高于对照组（P＜0.05）；p38/ATF2途径和该途径调节的细胞增殖相关靶基因的信号转导活动分别于2h、24-120h和2-72h显著高于对照组（P＜0.05）；JNK途径和该途径调节的细胞增殖相关靶基因的信号转导活动分别于2h、12-72h和6-24h、72h显著高于对照组（P＜0.05）。这些研究结果表明，IL-18可能通过NF-κB、p38/ATF2和JNK途径在大鼠肝再生的启动和进展阶段促进肝细胞增殖。
　　⑵研究了IL-18对大鼠正常肝细胞系BRL-3A的增殖调节作用。首先，用qRT-PCR和Western blot方法检测BRL-3A细胞周期中IL-18的表达变化。其次，通过重组大鼠IL-18蛋白（recombinant rat IL-18, rrIL-18）和小干扰 RNA（shortinterference RNA, siRNA）处理细胞，MTT和BrdU掺入法检测细胞增殖情况，流式细胞术检测细胞周期分布情况。最后，用qRT-PCR和Western blot方法检测IL-18通路相关基因和受通路调节的细胞增殖相关靶基因的表达变化。结果表明，同步化的BRL-3A细胞重新进入细胞周期后3.3h（G0/G1）和8.6h（G1/S）时，IL-18的mRNA和蛋白水平显著升高。用 siRNA干涉 IL-18表达后48h，细胞活力明显低于阴性对照组（negative control, NC）（P＜0.05），G2/M期的细胞比率也低于NC组。此外，5-10ng/ml的rrIL-18处理细胞后24h和48h，细胞活力显著高于对照组（P＜0.05）。同时，实验组的BrdU阳性细胞比率也明显升高（P＜0.05）。qRT-PCR和Western blot结果显示，NF-κB途径上游的募集蛋白MyD88、NF-κB及其调节的靶蛋白cyclin B1、cyclin B2均显著高于对照组；p38/ATF2途径的转录因子ATF2及其调节的靶蛋白cyclin A2和Bcl-2亦表达上调，用siRNA干涉BRL-3A细胞的IL-18表达，这些基因和蛋白的表达水平也随之降低。因此，我们推测 IL-18通过 NF-κB和 p38/ATF2途径，进一步激活与细胞增殖相关的靶基因CCNB1、CCNB2、CCNA2和Bcl-2的转录和表达，从而调节BRL-3A大鼠肝细胞增殖。
　　⑶用qRT-PCR和Western blot方法检测大鼠肝再生中IL-18在再生肝中的表达变化，用酶联免疫吸附测定法（enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA）检测大鼠肝再生中IL-18在下腔静脉血浆中的含量变化。其次，将rrIL-18通过尾静脉注入PH大鼠体内，用BrdU免疫荧光法检测再生肝的细胞增殖情况，然后，用qRT-PCR和Western blot方法检测IL-18通路相关基因及受通路调节的细胞增殖相关靶基因的表达变化。结果表明，IL-18的mRNA于PH后2h和36h显著升高（P＜0.05），12h和72h恢复至正常水平。同时，下腔静脉血浆中IL-18含量也于PH后2h开始升高，12h和48h两次达到高峰（P＜0.05）。此外，大鼠PH后立即注射rrIL-18，24h时检测再生肝的BrdU阳性细胞，结果表明4μg/只注射剂量组的BrdU阳性细胞比率显著高于对照组（P＜0.01）。qRT-PCR和Western blot结果表明， rrIL-18处理PH大鼠后24h，再生肝中的募集蛋白MyD88、转录因子NF-κB及其调节的靶蛋白cyclin B1和cyclin B2的表达量显著高于对照组；p38/ATF2途径调节的靶蛋白cyclin A2和Bcl-2亦表达上调，这些研究结果与其调节体外培养的大鼠肝细胞增殖的机制相一致。以上结果表明，大鼠肝再生中IL-18也激活了NF-κB、p38/ATF2途径，并进一步提高其下游靶蛋白cyclin B1、cyclinB2、cyclinA2和Bcl-2的表达量，从而促进大鼠再生肝的细胞增殖。

目录

第一章 文献综述

1.1 肝再生的分子机理

1.2 IL-18的研究进展

1.3 本论文的研究目的和意义

第二章 系统生物学分析大鼠肝再生中IL-18对肝细胞的增殖调节作用

引言

2.1 材料和方法

2.2 结果

2.3 讨论

第三章 IL-18对大鼠肝再生的调节作用研究

引言

3.1 材料和方法

3.2 结果

3.3 讨论

第四章 IL-18对大鼠正常肝细胞系BRL-3A增殖的调节作用研究

引言

4.1 材料和方法

4.2 结果

4.3 讨论

参考文献

总结与结论

创新点

附录 英文缩略语

致谢

攻读博士学位期间参加的科研项目和发表的论文

声明