多重耐药质粒pYN1在不同种属细菌中的水平转移能力研究

摘要

随着抗生素的广泛使用，尤其是前期抗生素不合理的滥用，造成临床和环境中产生严重的耐药性，给人类医疗和健康带来巨大威胁。其中，耐药基因由于在环境中不易降解、能够通过基因水平转移传播等特性而被作为一种污染物提出来，具有比抗生素本身更大的危害性。耐药基因主要存在于细菌的质粒上，其在环境中的水平转移主要通过质粒、转座子和噬菌体介导，其中质粒是最重要的传播方式。本研究在实验室前期工作的基础上，主要对多重耐药质粒在不同种属细菌之间的转移转化能力进行了研究，并探讨了抗生素和重金属暴露条件下对这种传播的影响。主要研究结果如下:
　　一、质粒pYN1在不同细菌中的转化能力研究:pYN1来自于本实验室保存的多重耐药菌株Escherichia coli Ls1，质粒全序列测序结果表明该质粒至少包括对头孢氨苄、四环素、卡那霉素三种抗生素的耐药基因和一个多重耐药超家族基因。将1.5 ug的Escherichia coli Ls1总质粒与100 ul的四种受体菌（枯草芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌和变形杆菌均为抗生素敏感菌株)，分别在不同的生长时期，室温下进行不同时间阶段的静置共培养。研究发现该质粒能够与培养18h以后的处于稳定期的受体菌株发生有效转化并在包含有三种抗生素的平板上产生转化子，对转化子提取质粒并进行琼脂糖凝胶电泳分析，均出现一条与多抗性质粒PYN1大小（约为15kb）一致的条带，从而进一步证明该质粒转化成功。然而该质粒在不同受体菌之间的转化能力存在明显差异，其转化率大小蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)为8.5×10-4＞变形杆菌（Proteusvulgaris）为4.7×10-6＞苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)为4.5×10-6＞枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)为2×10-7。
　　二、抗生素暴露对质粒pYN1在不同菌株中转化能力的影响:通过添加不同浓度、种类的抗生素对于多重耐药质粒pYN1在不同细菌种属之间自然转化的能力的影响进行研究，得到以下结论:抗生素的种类和浓度都会影响该质粒在受体菌中的转化。在头孢氨苄0-0.15 ug/ml、四环素0-0.3 ug/ml、卡那霉素0-1.5 ug/ml的范围内，对于质粒在枯草芽孢杆菌和变形杆菌中的转化效率增加102-103倍。在苏云金芽孢杆菌和蜡状芽孢杆菌中降低10-102倍;对不同处理条件下的受体菌株进行生长曲线测定，发现是降低的趋势;进行SDS-PAGE发现在0.5 ug/ml的卡那霉素和0.2 ug/ml的四环素处理条件下的枯草芽孢杆菌均有一条大于245 kD的蛋白条带的出现;进行HPLC实验分别发现在15.057和14.791 min处出现新峰。推测有可能是与抗胁迫作用相关的蛋白。
　　三、重金属暴露对质粒pYN1在不同菌株中转化能力的影响:选择环境中常见的重金属离子Cu2+、Mn2+、Zn2+、Fe2+研究了在不同剂量重金属离子分别暴露的条件下，对于多重耐药质粒pYN1在不同细菌种属之间自然转化的能力的影响进行研究。结果显示，重金属会影响该质粒在受体菌中的转化。其中，在铜离子浓度0-4 mmol/l范围内，对于枯草芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌和变形杆菌中的转化效率增加了102-103倍，苏云金芽孢杆菌降低了103倍;对于锰离子浓度0-9 mmol/l的条件下，在枯草芽孢杆菌和变形杆菌中的转化率是降低的，在苏云金芽孢杆菌和蜡状芽孢杆是升高的;在锌离子浓度为0-4mmol/l的范围内，对于在枯草芽孢杆菌和蜡状芽孢杆菌中的转化率提高10-102倍;对于苏云金芽孢杆菌和变形杆菌几乎没有影响;对于铁离子浓度0-4 mmol/l的条件下，对于在苏云金芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌和变形杆菌中的转化率降低102-103倍，对于在枯草芽孢杆菌中的转化率是升高的趋势;对于受体菌株生长曲线的测定，发现在不同重金属的处理条件下，对于生长趋势是增加的;对于枯草芽孢杆菌在不同重金属处理条件下菌体全蛋白的表达进行SDS-PAGE研究发现，与对照相比，铜离子、锰离子和锌离子处理条件下的枯草芽孢杆菌新出现一条180 kDa大小的条带，有可能与应对胁迫作用的相关蛋白表达量下调;进行HPLC实验发现在铜离子浓度为2mmol/l的处理下，与对照组15.072 min出现新峰。推测可能是与应对胁迫作用相关的蛋白。

目录

摘要

第一章 引言

1．1 抗生素的发展历史

1．2 抗生素的种类

1．3 抗生素抗性机制的阐明

1．4 抗生素抗性的产生与传播迁移

1．5 细菌耐药性的检测方法的阐述

1．6 抗生素残留对环境的影响

1．7 环境中抗生素耐药基因的研究现状

1．8 本研究的目的与意义

第二章 多重耐药质粒pYN1能否在不同细菌种属之间自然转化的研究

2．1 前言

2．2 材料和方法

2．2．1 药品

2．2．2 培养基

2．2．3 抗生素储备液的制备

2．2．4 抗生素抗性平板的制备

2．2．5 主要仪器

2．2．6 实验材料

2．2．7 多抗性菌株的活化

2．2．8 多抗性菌的总质粒的提取

2．2．9 提取的总质粒与受体菌静置共培养

2．2．10 转化子验证并计数

2．2．11 技术路线

2．3 结果与分析

2．3．1 受体菌生长曲线、抗生素MIC值测定以及转化效率的测定

2．3．2 质粒提取

2．3．3 转化子验证

2．4 小结

第三章 添加不同抗生素对于多重耐药质粒pYN1在不同细菌种属之间自然转化的影响的研究

3．1 前言

3．2 材料和方法

3．2．1 药品及试剂

3．2．2 实验方法

3．2．3 主要实验仪器

3．2．4 培养基

3．2．5 实验技术路线

3．2．6 转化子计数

3．2．7 聚丙烯酰胺凝胶电泳

3．2．8 高效液相对于菌体全蛋白的表达检测

3．3 结果和分析

3．3．1 不同头孢氨苄浓度对多抗性质粒转化效率的影响

3．3．2 不同四环素浓度对多抗性质粒转化效率的影响

3．3．3 不同卡那霉素对多抗性质粒转化效率的影响

3．3．4 不同抗生素对枯草芽孢杆菌生长状态及蛋白表达量的影响

3．3．5 不同抗生素对变形杆菌生长状态及蛋白表达量的影响

3．3．6 SDS-PAGE检测不同处理状态下枯草芽孢杆菌全蛋白的表达

3．3．7 高效液相对于不同处理条件下菌体全蛋白的表达检测

3．4 小结

第四章 添加不同重金属对于多重质粒pYN1在不同细菌种属之间自然转化的影响的研究

4．1 前言

4．2 材料和方法

4．2．1 材料

4．2．2 化学试剂

4．2．3 培养基

4．2．4 常用实验仪器

4．2．5 实验技术路线

4．2．6 转化子计数

4．2．7 SDS-PAGE检测不同处理状态下枯草芽孢杆菌全蛋白的表达

4．2．8 高效液相

4．3 结果和分析

4．3．1 受体菌对重金属最小抑菌浓度

4．3．2 不同铜离子浓度对多抗性质粒转化效率的影响

4．3．3 不同锰离子浓度对多抗性质粒转化效率的影响

4．3．4 不同锌离子浓度对多抗性质粒转化效率的影响

4．3．5 不同铁离子浓度对多抗性质粒转化效率的影响

4．3．6 不同重金属对枯草芽孢杆菌生长状态以及蛋白表达量的影响

4．3．7 不同重金属对变形杆菌生长状态以及蛋白表达量的影响

4．3．8 SDS-PAGE检测不同处理状态下枯草芽孢杆菌全蛋白的表达

4．3．9 高效液相对于不同重金属处理条件下菌体全蛋白的表达检测

4．4 小结

第五章 GFP标记多重耐药质粒pYN1

5．1 前言

5．2 材料和方法

5．2．1 材料

5．2．2 化学试剂

5．2．3 培养基

5．2．4 常用实验仪器

5．2．5 实验技术路线

5．2．6 GFP基因的克隆

5．2．7 质粒pYN1的提取

5．2．8 大肠杆菌DH5α感受态制备

5．2．9 热击法转化大肠杆菌感受态细胞

5．2．10 质粒pYN2的构建

5．3 结果和分析

5．3．1 转化子的平板验证与荧光显微镜检测

5．3．2 转化子的稳定性检测

5．3．3 GFP验证

5．4 小结

第六章 结论与展望

6．1 结论

6．2 展望

参考文献

致谢

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