一种新型化合物1,2,3-triazole-Jaspine B hybrids抑制胃癌细胞MGC803增殖作用机制的研究

摘要

近年来，从天然产物中寻找有效的抗肿瘤活性成分已经成了肿瘤治疗的研究热点。从海绵Pachastrissa sp.中首次分离获得Jaspine B，是一种神经鞘氨醇类化合物，具有显著抗癌活性，在此基础上将其与三氮唑通过点击化学方法重新合成一个新型化合物1，2，3-triazole-Jaspine B hybrids（编号为LHM）。通过对生物活性的研究发现LHM具有抑制胃癌细胞MGC803的增殖活性。因此本研究对LHM抑制胃癌细胞MGC803增殖作用进行了研究，并阐明其分子机制。
　　首先，利用荧光显微镜和Hoechst33342-PI双染色观察LHM处理MGC803细胞后，细胞形态和细胞核的变化;利用Western blot技术分析LHM影响MGC803细胞增殖相关蛋白表达变化情况;通过免疫共沉淀检测LHM作用后细胞自噬和坏死途径中相关复合体的形成。研究结果表明，LHM处理MGC803细胞24 h后，细胞的增殖活性随LHM浓度的增加而降低;就细胞形态而言，在低浓度下可以看出细胞表面出现空泡化，细胞膜有破裂现象，高浓度下细胞呈浓缩成团状态，悬浮于培养基中。
　　Western blot检测细胞凋亡相关蛋白如caspase-3、8、9和Bid、Bax、Bcl-2、Bcl-xl等，低浓度LHM处理后，这些相关蛋白表达量变化不大，但高浓度LHM处理后，这些相关蛋白均被激活，表达呈现剂量依赖性增加。为了探讨LHM诱导MGC803细胞死亡机制，进一步检测了自噬和坏死相关蛋白的变化情况，结果表明，自噬相关蛋白如LC3和Beclin1被激活，并呈现浓度依赖和时间依赖，在同种条件下坏死相关蛋白RIP1、RIP3、MLKL和p-MLKL等表达量均升高。与此同时免疫共沉淀结果表明，自噬和坏死发生过程中的复合体如Beclin1-Bc1-2\Bc1-x1、FADD-Cas8-RIP1-RIP3和RIP1-RIP3-MLKL发生显著变化，说明LHM处理后可能导致MGC803细胞产生了自噬和坏死。利用自噬和坏死抑制剂对照处理细胞结果表明LHM是通过诱导细胞自噬和坏死发挥作用的。
　　其次，通过流式细胞术研究发现LHM能够诱导MGC803细胞内活性氧(ROS)水平增高，因此，ROS在此过程中可能发挥了一定的作用。Western blot表明MAPK信号途径有参与其中，ERK和JNK被激活，并且JNK可能介导了自噬的产生。
　　综上所述，LHM具有抑制胃癌细胞MGC803的增殖作用，通过诱导细胞自噬和坏死的发生来发挥作用;自噬和坏死发生过程中活性氧有参与其中;JNK可能介导了自噬的发生。

目录

摘要

缩略词表

第一章 引言

1．1 研究背景

1．1．1 细胞凋亡

1．1．2 自噬

1．1．3 程序性细胞坏死

1．1．4 凋亡与自噬

1．1．5 凋亡与坏死

1．1．6 自噬与坏死

1．2 化合物1，2，3-triazole-Jaspine B hyblids

1．2．1 化合物1，2，3-triazole-Jaspine B hybrids的研究进展

1．2．2 研究目的和意义

第二章 材料和方法

2．1 实验材料

2．1．1 实验细胞

2．1．2 实验主要试剂

2．1．3 主要仪器设备

2．1．4 试剂的配置

2．2 胃癌细胞MGC803的培养

2．2．1 细胞培养的准备工作

2．2．2 实验步骤

2．3 MTT比色法和台盼蓝染色法确定LHM作用于MGC803的最适范围

2．3．1 MTT比色法检测

2．3．2 台盼蓝染色法检测

2．4 流式细胞术检测LHM对MGC803细胞凋亡的影响情况

2．5 流式细胞术检测LHM作用于MGC803细胞内活性氧变化

2．6 Hoechst33342-PI检测LHM对MGC803细胞形态变化

2．7 免疫印迹

2．7．1 BCA蛋白标准曲线的制备

2．7．2 免疫印迹

2．8 免疫沉淀检测

第三章 结果

3．1 MTT法测定LHM对不同肿瘤细胞的增殖抑制作用

3．2 LHM对MGC803作用最适浓度的选择

3．3 Western blot检测LHM诱导MGC803对凋亡相关蛋白表达的影响

3．4 LHM对MGC803中蛋白表达影响

3．5 活性氧参与LHM诱导MGC803的过程

3．6 检测自噬和坏死可能参与LHM诱导MGC803的过程

3．7 LHM诱导MGC803的动态过程

3．8 LHM诱导MGC803的动态过程中相关蛋白表达水平的变化

3．9 MAPK参与LHM诱导MGC803的动态过程

3．10 Bcl-2家族蛋白参与LHM诱导MGC803的过程

第四章 讨论

4．1 LHM对肿瘤细胞的基础研究

4．2 LHM作用MGC803后对相关蛋白表达影响

4．3 活性氧参与LHM诱导MGC803的过程

4．4 MAPK参与LHM诱导MGC803的动态过程

第五章 结论

参考文献

致谢

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