淇河鲫TLR5/TLR22及信号通路关键基因克隆、表达分析及功能研究

摘要

鱼类作为低等脊椎动物，其特异性免疫尚不完善，非特异性免疫在鱼类对外界刺激及病原微生物侵袭的防御反应中起着至关重要的作用。Toll样受体是非特异性免疫中一类重要的模式识别受体，能特异性地识别病原相关分子模式，通过细胞内信号通路的传递，进一步引发细胞的免疫应答，在鱼类免疫中发挥重要作用。淇河鲫（Qihe crucian carp，Carassius auratus）是河南特有的天然三倍体鱼类。近年来，随着淇河鲫养殖范围扩大，养殖密度增加，鱼类免疫力下降，疾病逐渐增多，从而给渔业生产带来重大损失。因此，弄清病原菌感染后淇河鲫模式识别受体免疫应答机制，对于理解淇河鲫免疫应答和疾病防控具有重要的理论意义和应用价值。嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)是淡水养殖鱼类暴发性传染病最主要的病原菌之一，常引起淇河鲫细菌性出血病，严重制约着淇河鲫养殖业健康发展。目前，淇河鲫感染嗜水气单胞菌后免疫反应的研究主要集中于生化指标测定和免疫基因表达变化，对淇河鲫模式识别受体免疫应答机制缺少系统研究。
　　本论文以淇河鲫为研究对象，首先克隆其13种TLRs的部分片段，实时荧光定量PCR检测嗜水气单胞菌攻毒后TLRs在脾脏和头肾中的表达变化，筛选出上调表达最为明显的TLR5和TLR22;然后对TLR5和TLR22及信号通路下游关键元件MyD88和TRAF6进行克隆，从而获得cDNA及基因组DNA全长序列，运用生物信息学方法进行结构预测及同源性分析;实时荧光定量PCR检测胚胎发育不同时期基因的表达变化、淇河鲫不同组织器官中的基因表达以及攻毒后各基因的表达响应。通过对基因进行原核表达，制备多克隆抗体，以研究蛋白表达;通过构建真核表达载体，转染HEK293T细胞系，检测相应分子的亚细胞定位及基因过表达后对下游NF-κB活性的调控作用。取得主要结果如下:
　　(1)以淇河鲫脾脏cDNA为模板，利用简并引物进行PCR扩增，得到13种TLRs(分别为TLR1、2、3、4、5、7、8、9、18、19、20、21和22)的部分片段。实时荧光定量PCR检测嗜水气单胞菌攻毒后不同时间(3、6、12、24和48 h)脾脏和头肾中13种TLRs的表达变化，结果显示TLR5和TLR22的表达上调最为明显，最高值分别达到了对照组的52.56倍和28.14倍，表明二者在淇河鲫防御嗜水气单胞菌感染的免疫应答中发挥重要作用，可能是淇河鲫识别嗜水气单胞菌的主要受体。同时，这也是对淡水鱼感染革兰氏阴性细菌后所有已知Toll样受体表达模式的首次研究。
　　(2)克隆得到淇河鲫TLR5、TLR2、MyD88和TRAF6 cDNA及基因组DNA全长序列。①TLR5 cDNA序列全长2972 bp，包含5'-UTR140 bp、开放阅读框2649 bp和3'-UTR183 bp，编码882个氨基酸;预测蛋白相对分子量为101.5 kD，理论等电点为5.33;含有1个信号肽、13个LRR基序、1个LRR-CT基序、1个跨膜区和1个TIR结构域;DNA序列含有一个长度为223 bp的内含子，位于5'-UTR。②TLR22 cDNA序列全长3613 bp，包含5'-UTR228 bp、开放阅读框2838 bp和3'-UTR547 bp，编码945个氨基酸;预测蛋白相对分子量为108.4kD，理论等电点为8.65;含有1个信号肽、15个LRR基序、1个LRR-CT基序、1个跨膜区和1个TIR结构域;DNA序列中没有内含子。③yD88 cDNA序列全长2463bp，包含5'-UTR191 bp、开放阅读框855bp和3'-UTR1417bp，编码284个氨基酸;预测蛋白相对分子量为33.1 kD，理论等电点为5.53;含有1个DEATH结构域和1个TIR结构域;DNA序列由5个外显子和4个内含子组成。④TRAF6 cDNA序列全长2555 bp，包含5'-UTR52bp、开放阅读框1632 bp和3'-UTR871 bp，编码543个氨基酸;预测蛋白相对分子量为61.7 kD，理论等电点为5.81;其蛋白质由5个结构域组成，分别是1个RING结构域、2个Zf-TRAF结构域、1个CCR结构域和1个MATH结构域;DNA序列由6个外显子和5个内含子组成。⑤对不同鱼类中氨基酸全长序列进行同源性分析，结果表明TLR5、TLR22、MyD88和TRAF6在鱼类中高度保守，推测其在鱼类中扮演重要的生物学功能。
　　(3)淇河鲫TLR5、TLR2、MyD88和TRAF6在个体发育早期阶段广泛表达，说明在淇河鲫胚胎及仔鱼发育的整个过程中起着重要的免疫保护作用。受精卵中表达量较高，均属于母源性基因，随着受精卵的发育，对母源性基因mRNA的消耗，胚胎中基因表达量逐渐降低，分别在原肠胚期（TLR5）、尾芽期（TLR22）、出膜期（MyD88和TRAF6）达到最低值，胚胎出膜后基因表达量明显增加。这一研究结果提示:在鱼类受精卵发育过程中，出膜前是免疫水平和抗病能力最薄弱阶段，需加强照管，防止病原菌侵染鱼类胚胎。
　　(4)淇河鲫TLR5、TLR2、MyD88和TRAF6在不同组织器官中呈组成型表达，但其mRNA表达水平具有明显的组织特异性。①TLR5在肾脏中表达量最高，其次是肝脏、头肾、心脏和肌肉，鳃中表达量最低。②TLR22在头肾中表达量最高，其次是肾脏、肌肉、肝脏和肠道;心脏和脑中表达量偏低。③MyD88在脾脏中表达量最高，肝脏、血液、肌肉、头肾、肾脏和鳃次之，皮肤中表达量最低。④TRAF6在肌肉中表达量最高，血液次之，脾脏、肾脏、头肾、皮肤和肠道中表达水平差异不显著，鳃中表达量偏低。
　　(5) PolyI:C、鞭毛蛋白和嗜水气单胞菌攻毒后淇河鲫TLR5和TLR22及其信号通路关键分子均表现出明显的表达响应，充分显示了细菌感染后TLRs及信号通路关键元件在淇河鲫免疫应答反应中发挥重要作用。攻毒后淇河鲫TLR5和TLR22的表达峰值多出现在早期(3-12 h)，MyD88表达峰值多出现在处理后24 h，说明信号通路上不同元件的表达响应存在时间差异。攻毒后淇河鲫促炎细胞因子IL-1β、IL-8和TNFα的表达普遍上调，其中IL-1β的表达量特别高，说明其在鱼类免疫中发挥重要作用。
　　(6)利用大肠杆菌表达系统表达并纯化了淇河鲫TLR5、TLR22和TRAF6部分片段以及MyD88全长的融合蛋白，分别用纯化蛋白免疫小鼠，成功制备相应多克隆抗体，为进一步通过标记蛋白质进行相关研究奠定基础。
　　(7)构建GFP标记的真核表达重组载体，然后转染HEK293T细胞系，激光共聚焦显微镜观察融合蛋白的亚细胞定位，结果显示TLR5/22-TIR结构域融合蛋白主要分布在细胞质中靠近细胞膜的位置，这预示着淇河鲫TLR5/22全长分子可能位于细胞膜上;MyD88和TRAF6则位于细胞质中。
　　(8)目的片段与pcDNA3.1连接构建真核表达重组载体，分别与NF-κB荧光素酶报告基因载体共转染HEK293T细胞系，利用双荧光素酶报告基因检测法测定目的基因过表达对NF-κB活性的影响，结果显示过表达TLR5-TIR结构域、TLR22-TIR结构域和MyD88均能显著增加NF-κB的活性，表明三者在哺乳动物细胞中能正常行使其信号转导功能，激活下游信号通路;但过表达TRAF6对NF-κB的活性没有明显影响，推测可能是因为淇河鲫TRAF6与哺乳动物同源分子之间蛋白结构存在差异，在哺乳动物细胞中难以正常发挥其功能。

目录

摘要

第一章 绪论

1．1 Toll样受体的发现和种类

1．2 TLRs的结构

1．3 TLRs对细菌性配体的识别

1．3．1 TLR1和TLR2

1．3．2 TLR4

1．3．3 TLR5

1．3．4 TLR9

1．3．5 非哺乳类TLRs

1．4 TLRs信号通路

1．4．1 MyD88依赖型信号通路

1．4．2 MyD88非依赖型信号通路

1．5 本研究的目的和意义

第二章 淇河鲫TLRs对嗜水气单胞菌感染的表达响应

2．1 实验材料

2．1．1 实验鱼

2．1．2 嗜水气单胞菌

2．1．3 主要试剂

2．2 实验方法

2．2．1 嗜水气单胞菌攻毒及样品采集

2．2．2 总RNA提取及cDNA合成

2．2．3 淇河鲫TLRs基因部分片段克隆

2．2．4 实时荧光定量PCR

2．2．5 数据分析

2．3 结果与分析

2．3．1 淇河鲫总RNA提取

2．3．2 淇河鲫13种TLRs基因部分片段克隆

2．3．3 淇河鲫13种TLRs对嗜水气单胞菌感染的表达响应

2．4 讨论

2．5 小结

第三章 淇河鲫TLR5／TLR22／MyD88／TRAF6基因克隆及序列分析

3．1 实验材料

3．1．1 实验鱼

3．1．2 主要试剂

3．2 实验方法

3．2．1 脾脏总RNA提取及cDNA合成

3．2．2 TLR5／TLR22／MyD88／TRAF6 cDNA序列克隆

3．2．3 淇河鲫肌肉基因组DNA提取

3．2．4 TLR5／TLR22／MyD88／TRAF6基因组DNA序列扩增

3．2．5 序列分析

3．3 结果与分析

3．3．1 淇河鲫TLR5序列分析

3．3．2 淇河鲫TLR22序列分析

3．3．3 淇河鲫MyD88序列分析

3．3．4 淇河鲫TRAF6序列分析

3．4 讨论

3．5 小结

第四章 淇河鲫TLR5／TLR22及信号通路关键基因表达分析

4．1 实验材料

4．1．1 实验鱼

4．1．2 嗜水气单胞菌

4．1．3 主要试剂

4．2 实验方法

4．2．1 淇河鲫胚胎发育不同时期样品采集

4．2．2 淇河鲫不同组织器官样品采集

4．2．3 嗜水气单胞菌、鞭毛蛋白和PolyI：C攻毒及样品采集

4．2．4 总RNA提取及cDNA合成

4．2．5 淇河鲫IL-1β、IL-8和TNFα部分片段的克隆

4．2．6 实时荧光定量PCR

4．2．7 数据分析

4．3 结果与分析

4．3．1 淇河鲫总RNA提取

4．3．2 淇河鲫IL-1β、IL-8和TNFα部分片段的克隆

4．3．3 淇河鲫TLR5的表达分析

4．3．4 淇河鲫TLR22的表达分析

4．3．5 淇河鲫MyD88的表达分析

4．3．6 淇河鲫TRAF6的表达分析

4．3．7 攻毒后淇河鲫促炎细胞因子IL-1β、IL-8和TNFα的表达变化

4．4 讨论

4．4．1 淇河鲫胚胎发育过程中TLR5／TLR22／MyD88／TRAF6的表达变化

4．4．2 淇河鲫不同组织器官中TLR5／TLR22／MyD88／TRAF6的表达

4．4．3 攻毒后淇河鲫TLR5／TLR22及信号通路关键基因的表达响应

4．5 小结

第五章 淇河鲫TLR5／TLR22／MyD88／TRAF6的原核表达及多克隆抗体制备

5．1 实验材料

5．1．1 细菌与载体

5．1．2 主要试剂

5．2 实验方法

5．2．1 原核表达载体的构建

5．2．2 融合蛋白诱导表达条件的优化

5．2．3 融合蛋白可溶性分析

5．2．4 大量融合蛋白的制备及纯化

5．2．5 多克隆抗体的制备

5．2．6 SDS-PAGE

5．2．7 Western blot

5．3 结果与分析

5．3．1 目的片段的扩增及重组表达载体的构建

5．3．2 敲合蛋白表达条件的优化

5．3．3 融合蛋白可溶性分析

5．3．4 融合蛋白的纯化

5．3．5 多克隆抗体的制备

5．4 讨论

5．5 小结

第六章 淇河鲫TLR5／TLR22／MyD88／TRAF6信号转导功能的初步研究

6．1 实验材料

6．1．1 细胞和载体

6．1．2 主要试剂

6．2 实验方法

6．2．1 真核表达载体的构建

6．2．2 无内毒素质粒的提取

6．2．3 重组质粒的转染

6．2．4 亚细胞定位

6．2．5 双荧光素酶报告基因检测

6．3 结果与分析

6．3．1 目的片段的扩增及重组表达载体的构建

6．3．2 亚细胞定位

6．3．3 过表达TLR5／TLR22／MyD88／TRAF6对NF-κB活性的影响

6．4 讨论

6．5 小结

第七章 全文总结

参考文献

附录

致谢

攻读学位期间发表的学术论文

声明