马圆线虫COI和nad1序列测定及系统发育分析

摘要

圆线虫是马属动物体内最重要的寄生虫，严重危害宿主的健康，使其患病乃至死亡，对畜牧养殖业造成较大损失。大量使用驱虫药使盅口线虫出现抗药性，增加了患病率。马属动物寄生圆线虫的分类鉴定和系统发育学研究，对于有针对性地控制圆线虫病具有重大意义。目前，国外学者为圆线虫的研究提供了丰富的数据资料，国内对于圆线虫的研究较少，且主要是形态学方面的研究，缺乏相关分子资料。本研究以采自河南新乡地区的35种圆线虫为研究对象，经光学显微镜初步鉴定后，通过PCR技术扩增其线粒体COⅠ和nad1基因，探究马圆线虫的系统发育关系。35种圆线虫的扩增产物经测序共获得39条COⅠ序列和32条nad1序列。通过使用多种生物学软件，对所得目的片段进行了碱基组成、遗传距离等分析。采用最大似然法(ML)和贝叶斯法(BI)分别基于COⅠ和nad1序列构建系统发育树，并且构建基于COⅠ和nad1联合数据集的系统树。发现BI法更适合马圆线虫的系统发育学研究。
　　本研究主要内容包括：⑴所测样品的COⅠ序列长度均为393 bp，通过多序列比对显示，其中保守位点、变异位点、简约信息位点、单核苷酸位点分别占总位点的64.63％、35.37％、29.52％、5.85％。A+T平均含量(67.3％)明显高于G+C(32.7％)，表现出明显的AT碱基偏好性。从氨基酸密码子来看，第三位点的A+T平均含量最高(78.6％)，第二位点(63.1％)稍高于第一位点(61.2％)。转换和颠换比值R最大的是第1密码子位点，其次是第3密码子位点，进化最快，第2密码子位点没有发生碱基替换，进化最慢。基于COⅠ序列构建的系统树显示，种内个体均聚为独立分支，对于属以上分类阶元的区分结果不够理想，但仍有一定的参考价值。⑵测序所得32条nad1序列的总长度均为354 bp，对序列进行多序列比对分析，其中保守位点218个，变异位点136个，简约信息位点115个，单核苷酸位点21个。A、C、G、T四种碱基的平均含量为25.4％、9.8％、21.7％、43.1％，A+T平均含量(68.5％)明显高于G+C(31.4％)，表现出AT碱基偏倚性。就氨基酸密码子来看，A+T平均含量最高(74.2％)的是第3位点，第1位点(66.1％)和第2位点(65.1％)相差不大。三个密码子位点的转换和颠换比值R最小的为第3密码子位点，进化最快，其次是第1密码子位点，第2密码子位点的R值最大，进化速率最慢。在构建的系统树中，31种圆线虫形成两大类群:一个大类群包括圆形属、三齿属和卡拉干斯齿线虫、不等齿杯口线虫以及伊氏双齿口线虫;另一大类群包括杯冠属、杯环属、冠环属、盅口属和杯状彼得洛夫线虫、拉氏杯口线虫、双冠双冠线虫、头似辅首线虫。其中冠环属、盅口属和杯冠属的亲缘关系较近;长形杯环线虫和外射杯环线虫与杯环属的亲缘关系较远。基于COⅠ+nad1序列构建的系统发育树拓扑结构与之类似，仅支持率存在差异。采用ML法重建圆线虫的系统进化关系自展支持率较低，BI法构建的系统树支持率高，说明依据COⅠ和nad1序列进行圆线虫的系统发育分析时，BI法更加适合。⑶在河南省发现卡拉干斯齿线虫（Skrjabinodentus caragandicus），对其进行了形态学观察和分子序列测定与分析。结果表明:卡拉干斯齿线虫中等大小，口囊壁呈“S”状，前端极度膨大，厚10～12μm，后端稍薄，约4～6μm，外叶冠由8个长而宽的小叶组成，内叶冠由16～18个短而宽的小叶组成，食道漏斗发达，雄虫生殖锥长337μm，引器长245μm;所测核糖体DNA(rDNA)内转录间隔区(ITS)及5.8S片段长度为853 bp，其中ITS1长369 bp，ITS2长331 bp，从GC含量上看，ITS1区(47.2％)明显高于ITS2区(40.7％);线粒体细胞色素c氧化酶亚基Ⅰ(COⅠ)基因长度为393 bp，A、T、G、C碱基含量分别为25.2％、42.7％、21.4％、10.7％; nad1序列长354 bp，其中A、T、G、C碱基的含量分别为24.9％、43.5％、21.5％、10.2％。卡拉干斯齿线虫在河南省属首次报道，为河南省新记录种。

目录

摘要

第一章 绪论

1．1 马圆线虫的研究概况

1．2 马圆线虫的分类

1．3 马圆线虫的寄生部位与致病机理

1．4 圆线虫病的防治

1．5 DNA分子标记技术在寄生虫分类学中的应用

1．5．1 不依赖PCR技术的分子标记

1．5．2 依赖PCR技术的分子标记

1．5．3 基于线粒体基因的物种鉴定和系统发育分析

1．6 本研究的内容与意义

第二章 马圆线虫的分子系统分析

2．1 材料与方法

2．1．1 虫体样本

2．1．2 主要仪器设备与试剂

2．1．3 主要分析软件

2．1．4 光镜下的形态学初步鉴定

2．1．5 虫体总DNA的提取

2．1．6 COI及nad1序列的PCR扩增

2．1．7 琼脂糖凝胶电泳分析

2．1．8 PCR产物的纯化回收与测序

2．1．9 测序结果比对分析及系统发育树的构建

2．2 COI序列扩增及系统发育分析结果

2．2．2 COI基因序列分析

2．2．3 圆线虫与外群COI序列的遗传距离

2．2．4 基于COI序列的系统发育分析

2．3 nad1序列扩增及系统发育分析结果

2．3．2 nad1基因序列分析

2．3．3 圆线虫与外群nad1序列的遗传距离

2．3．4 基于nad1序列的系统发育分析

2．3．5 基于nad1+COI序列的系统发育分析

2．4 讨论

第三章 卡拉干斯齿线虫的形态及分子序列分析

3．1 卡拉干斯齿线虫的分类研究概况

3．2 材料与方法

3．2．1 标本采集与形态观察

3．2．2 基因组DNA的提取和目的片段的扩增

3．3 结果

3．3．1 形态特征描述

3．3．2 ITS序列分析

3．3．3 COI序列分析

3．3．4 nad1序列分析

3．4 讨论

第四章 结论

参考文献

致谢

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