黄河鲤卵巢发育相关microRNA的鉴定及生物学功能的初步研究

摘要

鱼类是数目较多的一种脊椎动物，是人类重要的蛋白质来源，由于雌雄性别成熟迟早有别，两性个体在生长速度上有差别是较为普遍的现象。探讨鱼类性别分化和性腺发育的分子机制在渔业养殖和对人们了解生物性别决定机制都具有重要的意义。鱼类性别决定和分化的类别非常多，受到遗传因素和环境因素等多方面的影响。rniRNA是近几年发现的在转录后水平对基因进行调控的小分子RNA，研究证实其参与了生殖细胞发生、配子形成、受精直至胚胎发育等生殖过程，在性别决定、性腺发育方面起重要影响。
　　黄河鲤（Cyprinus carpio）是养殖比较广泛的淡水鱼类，具有性别二态性特征且雌性比雄性发育快。至今，人们对miRNA在鲤鱼性腺分化和发育过程中的分子调控机制的研究还不多。本论文采用阿特拉津(ATR)和来曲唑(LET)处理幼鱼雌雄性腺，检测其对性腺分化方向的影响，并分析了二者影响卵巢分化的分子机制;通过高通量测序方法鉴定了黄河鲤卵巢发育5个关键时期表达的miRNA，鉴定了5个卵巢发育时期表达差异的miRNA、预测了卵巢表达miRNA的靶基因、通过对靶基因进行KEGG通路和GO富集分析对miRNA进行功能分析;本文还通过ATR和LET的暴露实验，来分析它们对2个发育关键时期性腺中miRNA表达的影响，从而进一步分析其在外源激素的干扰下miRNA参与或影响卵巢分化的分子机制;筛选了8个黄河鲤卵巢分化发育过程中高表达和差异表达的miRNAs，并对进一步这8个miRNAs可能的调控功能进行了分析，为揭示miRNA在黄河鲤卵巢分化发育过程中的调控机制提供新的研究依据。取得以下结果:
　　1.分析了环境内分泌干扰物(ATR和LET)对黄河鲤性腺分化的影响机制，结果发现ATR和LET不只能影响芳香化酶基因的表达，还能影响Foxl2、Dax等上游基因的表达，最终影响性腺的分化和发育。
　　通过不同浓度ATR和LET暴露幼稚黄河鲤，来观察其对黄河鲤性别比例的影响和对性别相关基因表达的影响。结果发现:(1)高浓度LET导致性别比例偏雄性，高浓度ATR导致性别比例偏雌性;(2)组织学观察发现LET能抑制雌性卵母细胞的发育而促进雄性精巢的发育，而ATR能促进雌性卵母细胞的发育而抑制雄性精巢的发育;(3)长期及高浓度LET处理使雌性相关基因的表达如Cyp19A、Cyp19B、ERa、Dax和Foxl2表达下调，使雄性相关基因的表达如Dmrt1表达上调。而ATR的影响则相反。说明LET和ATR暴露能影响黄河鲤性别分化，且分子机制不但涉及芳香化酶还涉及一些相关上游基因。
　　2.关键时期miRNA的鉴定、表达和功能分析:丰富了鲤鱼miRNA的数量;筛选了在黄河鲤性腺分化和卵巢发育过程中起重要调控作用的miRNA，如miR-101b、miR-181a等;通过靶基因预测发现这些miRNAs靶向性别发育相关的基因，如cyp19、foxl2、gsdf等;通过通路分析发现这些靶基因参与的通路与性腺分化和卵巢发育有关，如TGF-β信号通路、Wnt信号通路等。
　　通过高通量测序方法统计分析了不同长度的小RNA的分布，发现测序的小RNA长度主要分布在20-23nt区域，但在幼稚卵巢小RNA长度峰值分布在25-26nt，这些小RNA可能是piRNA。5个卵巢发育时期（神经胚期、去卵黄期、原始性腺期、幼稚卵巢、成熟卵巢）分别鉴定到了517、946、942、989和737个保守miRNAs，145、139、143、143和145个已存在的miRNAs，3，278、3，257、3，188、4，480和3，192个新miRNAs。同时我们还分析了在5个时期特异表达、共表达和差异表达的miRNA。靶基因分析显示预测到的靶基因包括性别发育相关的如cyp19、foxl2、ATM,gsdf,dmrt、smad4等。通路分析显示预测到的靶基因富集到与性腺分化发育推测这些高表达、差异表达和特异表达的miRNAs可能参与了黄河鲤早期的性腺的分化以及卵巢的发育调控过程。
　　3.分析了环境内分泌干扰物(ATR和LET)对黄河鲤性腺分化过程中miRNA表达的影响机制，筛选了ATR和LET处理下性腺发育关键时期卵巢差异表达的miRNAs，通过靶基因预测发现这些miRNAs靶向性别发育相关的基因，如cyp19、sf1和dmrt1等，通过通路分析发现这些靶基因参与的通路与性腺分化和卵巢发育有关，如TGF-β信号通路、Wnt信号通路等。
　　用ATR和LET暴露2个黄河鲤发育关键时期的卵巢，鉴定miRNA的表达，对miRNA差异表达进行分析，进行靶基因分析和通路分析。原始性腺时期，ATR处理使得大量miRNAs的表达发生了变化。ATR暴露不仅影响了鉴定到的miRNAs数量，也影响了miRNAs的表达水平。ATR处理8h、24h对黄河鲤幼稚精巢和幼稚卵巢中miRNAs的表达变化影响也是不一样的。靶基因分析结果显示，许多miRNAs靶向性腺分化相关的关键基因foxl2，stat1，sf1，dmrt1，gsdf，smad3，smad4，sox9和ATM。靶基因KEGG富集分析，共富集了288个信号通路，这些信号通路多数是与性别发育相关，如TGF-β信号通路、Wnt信号通路、MAPK信号通路、p53信号通路、GnRH信号通路、类固醇激素合成通路、雌激素信号通路等。我们推测这些ATR和LET处理后表达显著上调或下调的miRNAs在黄河鲤早期性腺分化和发育中起着决定性的作用，这些miRNAs作用的分子机制可能是通过改变原始性腺中miRNA的表达而调控卵巢分化的关键基因和信号通路尤其是类固醇激素生物合成通路而实现的。
　　4.分析了8个黄河鲤卵巢分化发育过程中高表达和差异表达的miRNAs调控功能的机制，验证了10对miRNAs与靶基因的靶向关系。
　　结合前面建立的黄河鲤卵巢分化发育关键阶段miRNA表达谱，选取了8个高表达、差异表达且预测的靶基因中有与性别决定相关的基因的miRNAs。荧光定量检测发现其中5个miRNAs和预测的靶基因在幼稚黄河鲤不同组织中的表达水平呈负相关。双荧光素酶报告系统实验证明了7个miRNAs可以直接结合其对应的靶基因rnRNA的3'UTR。在培养的幼稚卵巢中，转染7个miRNA mimics可以抑制其靶基因蛋白的表达。这也是第一次在黄河鲤卵巢发育关键时期证明具有调控功能的miRNA-靶基因对。
　　总之，本文全面分析了黄河鲤卵巢分化过程中5个关键时期的miRNA的种类、数量和结构特征及其可能的功能，发现了各时期特异表达、高表达以及相互间差异表达的miRNA。靶基因分析和通路分析表明，这些miRNA参与了卵巢的发育和分化过程。选择特征性表达的8个miRNA，分析验证了它们与靶基因之间的关系，证明了它们可以显著抑制靶基因的表达和蛋白质水平。LET和ATR能够显著改变黄河鲤性别分化的比例。LET和ATR的暴露显著改变了部分miRNA的表达水平，这些miRNA的靶基因除cyp19基因之外，主要集中在与性别决定和性腺分化相关的基因和信号通路中，表明LET等外源激素类似物影响性腺分化的机理不仅在于改变了cyp19基因及其相应miRNA的表达模式，更重要的是通过影响性腺分化早期基因及其对应的miRNA表达模式而实现的。这些结论对于揭示miRNA在卵巢分化过程中的功能和外因影响卵巢分化的分子机制具有重要意义。

目录

摘要

第一部分 绪论

1．1 miRNA的发现和命名规则

1．2 miRNA的生物形成过程和作用机制

1．3 miRNA的功能

第二章 miRNA在动物生殖过程中的作用

2．1 miRNA与雄性生殖调控

2．2 miRNA与雌性生殖调控

第三章 鱼类的性别决定和miRNA的研究进展

3．1 鱼类性别决定

3．2 鱼类卵巢分化发育的机理

3．3 本研究的目的和意义

第二部分 来曲唑和阿特拉津对黄河鲤性腺分化的影响及分子机制探讨

4．1 材料与方法

4．2 结果

4．3 讨论

4．4 小结和结论

第五章 阿特拉津对黄河鲤性腺分化的影响及分子机制的探讨

5．1 材料与方法

5．2 结果

5．3 讨论

5．4 小结和结论

第三部分 黄河鲤卵巢发育关键时期相关miRNA的鉴定、结构和功能分析

6．1 材料与方法

6．2 结果

6．3 讨论

第七章 黄河鲤卵巢发育关键时期RNA文库的构建和Solexa测序分析

7．1 材料与方法

7．2 结果

7．3 分析与讨论

第八章 黄河鲤卵巢发育相关miRNA的鉴定、表达和功能分析

8．1 材料与方法

8．2 结果

8．3 讨论

第四部分 阿特拉津和来曲唑处理下黄河鲤卵巢发育相关miRNA的鉴定、特征和分析

第九章 阿特拉津处理下黄河鲤卵巢RNA文库的构建和Solexa测序分析

9．1 材料与方法

9．2 结果

9．3 讨论

第十章 阿特拉津处理下黄河鲤卵巢发育相关miRNA的鉴定、表达和功能分析

10．1 材料与方法

10．2 结果

10．3 讨论

第十一章 来曲唑处理下黄河鲤卵巢小RNA文库的构建和Solexa测序分析

11．1 材料与方法

11．2 结果

11．3 讨论

第十二章 来曲唑处理下黄河鲤卵巢发育相关miRNA的鉴定、表达和功能分析

12．1 材料与方法

12．2 结果

12．3 讨论

第五部分 8个黄河鲤卵巢发育相关miRNAs生物学功能的初步研究

第十三章 8个黄河鲤性腺(卵巢)发育相关miRNAs生物学功能的初步研究

13．1 实验材料

13．2 实验步骤和方法

13．3 结果

13．4 讨论

结论

参考文献

致谢

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