H1N1亚型SIV河南株的分离鉴定、HA基因的克隆和序列分析及荧光定量PCR诊断方法的建立

摘要

猪流感是世界范围内常见的呼吸系统传染病之一，早在上世纪二十年代就开始在美洲流行。常与其它病原共同感染而加重了对世界各国的养殖业的危害。此外，由于猪被称为是流感病毒的组合器，猪流感病毒因而在公共卫生方面也有着十分重要的意义。流感病毒亚型众多和容易变异的特点给该病的诊断和防治带来了诸多挑战。H1N1是猪流感最常见的亚型之一，在我国多个省份都有过报道。为了研究猪流感病毒的分子流行病学变化规律，找到准确、敏感的诊断方法，为猪流感的防治奠定分子生物学角度的基础和依据，本试验从河南本地猪场分离了H1N1亚型猪流感病毒，并建立了能够对病料进行定量检测的实时荧光定量PCR诊断方法。 病毒被命名为A/Swine/Henan/407/2005(H1N1)(简称为SHN407)，为热不稳定型，对酸敏感，能导致小白鼠发病、死亡。从存活的小白鼠血清中可以检测到特异性抗体，EID50，ELD50分别为10-6.5和10-1.75。从GenBank上下载了世界各地多个典型H1N1亚型毒株HA基因，在编码区以外相对保守区设计了一对特异性引物，通过RT-PCR方法扩增出SHN407株的HA基因，然后将其克隆到pGEM-T载体上，转化到JM109大肠杆菌中，经蓝白斑筛选后将阳性菌株的重组质粒测序。序列分析发现该毒株的HA基因全长1701bp。HA全基因共编码566个氨基酸，其中HA1包含330个、HA2包含221个。共有7个糖基化位点，其中HA1上有5个、HA2上有2个。裂解位点附近没有碱性氨基酸存在，不具有高致病性毒株的特征。HA基因的同源性及系统发育树显示，该毒株与香港、中国内地、北美的古典H1N1亚型分离株的亲缘关系较远，而与欧洲各国流行株的亲缘关系较近，为典型的类禽H1N1亚型猪流感病毒。 从GenBank上下载了来自世界各地多个典型毒株的NP基因，利用DNAstar软件进行分析比较，在大约1300-1500bp之间发现了一个相对保守区。利用Premierexpress引物设计软件找到了一对引物和相应的探针序列。在探针的5'端以FAM标记；3'TAMRA标记。利用上述引物，通过RT-PCR方法扩增出SHN407株的部分NP基因，然后将其克隆到pGEM-T载体上，转化到JM109大肠杆菌中，经蓝白斑筛选后将阳性菌株测序，测序结果证实扩增的序列完全正确。将从细菌中提取的重组阳性质粒10倍梯度稀释，作为阳性定量标准模板，用于标准曲线的建立和样品的检测。本试验经过对探针浓度、引物浓度、镁离子浓度和退火温度的一系列优化比较，建立了最佳的反应体系和扩增程序，标准曲线上各点均匀一致。该方法对H3N2、H9N2等流感病毒亚型以及猪体内常见的多种病毒对比试验均显示阴性。与普通PCR方法相比，荧光定量PCR不仅解决了不能绝对定量的难题，在定性检测上也更为敏感。H1N1亚型荧光定量PCR诊断方法的建立为猪流感的病理研究创造了有利条件。

目录

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致谢

摘要

文献综述

引言

实验一猪流感病毒的分离与鉴定

实验二H1N1亚型猪流感病毒HA基因的克隆和序列分析

实验三H1N1亚型猪流感荧光定量PCR诊断方法的建立

参考文献