小麦成熟胚脱分化过程中cdpks及其相关基因的差异表达分析

摘要

CDPKs是目前所知Ca2+信号的转导途径中重要成员之一，参与调节了植物生长发育的许多重要过程。为了研究CDPKs在小麦成熟胚脱分化过程中的作用，本研究以离体小麦（豫麦18）成熟胚为材料，2，4-D处理0、2、6、12、24和72h，提取RNA，利用Affymetrix基因芯片技术检测各时点基因的表达信号，分析其中cdpks及其相关基因的差异表达，并选择其中关键基因进行real time-PCR验证，以期阐明cdpks在此过程中的可能作用。 研究结果表明：在含有61127个探针组，代表了55085个基因的小麦基因组表达芯片上，发生有意义表达变化的基因共约有15000个，有15个CDPKs基因在小麦成熟胚脱分化过程中发生了意义变化，其中上调表达基因12个，上调2～7．5倍，下调表达基因2个，下调3～6．1倍，在不同时点有上调又有下调的1个，表明这些基因产物可能参与调控了脱分化的进程。根据已知CDPKs生物功能和它们表达变化趋势以及这些变化趋势与脱分化过程中的吻合程度分析，推测CPK2A、CPK2B，CPK6和Os12g0169800（BQ280973）参与了小麦成熟胚脱分化过程的启动和愈伤组织的形成。 为进一步研究cdpks及其相关基因的表达与小麦成熟胚脱分化进程的关系，我们从芯片检测结果中共检测到CDPK靶基因及上游基因45个，分析表明这些基因在各时点表达的趋势与CDPKs基因的表达趋势基本一致；通过对比cdpks（CA654806和BQ280973）与14-3-3蛋白基因（AF548740．1）和质膜H+-ATPase基因（AY543630．1，又称hal）在成熟胚脱分化过程中各时点的表达趋势，本文初步确定了Ca2+转导途径中几个重要成员作用的先后次序：14-3-3蛋白→CDPKs基因（CA654806和BQ280973）→质膜H+-ATPase。 通过对BQ280973及其下游靶基因质膜H+-ATPase基因hal进行Real Time PCR检测，我们发现：一方面这2个基因在成熟胚脱分化过程中有着活跃的表达变化，说明它们参与了小麦成熟胚的脱分化进程；另一方面Real Time PCR检测结果表明在脱分化的前期（6 h）它们的基因拷贝数达到最大值，暗示BQ280973和PM H+-ATPase参与生长素（2，4-D）诱导的脱分化过程的启动。同时这与芯片检测结果比较一致，表明该基因芯片结果可靠。 本研究利用高通量的小麦基因芯片，在基因转录水平分析了cdpks以及其上下游相关基因在小麦成熟胚脱分化过程中的表达变化，首次将CDPKs与小麦成熟胚脱分化过程联系起来，为进一步揭示小麦成熟胚脱分化的分子机理开辟了新的研究思路。

目录

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致谢

1 文献综述

1.1 钙依赖蛋白激酶(CDPKs)

1.1.1 CDPKs的结构

1.1.2 CDPKs酶活性的调控

1.1.3 CDPKs在植物信号转导中的作用

1.1.4 小结

1.2 质膜质子泵

1.3 14—3—3 蛋白质

1.4 细胞骨架

1.5 植物组织培养技术及相关概念

1.6 小麦成熟胚组织培养研究进展

1.7 芯片技术

2 引言

3 材料与方法

3.1 材料处理

3.2 RNA提取与纯化

3.2.1 RNA提取

3.2.2 RNA定量和检测

3.2.3 RNA纯化

3.3 cDNA、cRNA的合成与纯化

3.3.1 cDNA的合成与纯化

3.3.2 cRNA的合成与纯化

3.4 cRNA片断化和芯片检测

3.4.1 cRNA片断化

3.4.2 芯片检测

3.5 芯片数据处理与CDPKs及其相关基因的确认

3.6 Real Time—PCR 分析

3.6.1 hal Real Time PCR分析

3.6.2 Os12g0169800(BQ280973)Real Time PCR分析

4 结果与分析

4.1 CDPKs基因在成熟胚脱分化中的表达

4.1.1 CDPKs基因在小麦胚脱分化过程中的表达丰度

4.1.2 不同CDPK基因表达水平差异性分析

4.2 CDPKs相关基因在成熟胚脱分化中的表达

4.2.1 小麦成熟胚脱分化过程中CDPKs相关基因的数目及表达

4.2.2 小麦成熟胚脱分化过程中CDPK相关基因的功能分类及表达

4.3 CDPK基因的上游及下游基因在成熟胚脱分化中的确认

4.4 小麦成熟胚脱分化中BQ280973 和hal的Real Time PCP结果

5 结论与讨论

5.1 结论

5.2 讨论

5.2.1 CDPKs在成熟胚脱分化过程中的生理功能

5.2.2 2，4—D诱导下的CA654806 和BQ280973 在成熟胚脱分化过程中的作用

5.3 结语

参考文献

已发表的文章