植酸酶基因在乳酪杆菌中的高效表达及生化特性研究

摘要

本研究通过电击转化将来自无花果曲霉的植酸酶基因与原核表达载体pIAβ8构建的重组载体pIAβ8-phyA转入乳酪杆菌中，并对转基因乳酪杆菌的培养特性以及分泌的植酸酶进行酶学特性分析。选用不同包埋材料对转基因乳酪杆菌进行包埋，并运用不同的方法进行干燥处理。最后，通过测定乳酸菌对不同抗生素的耐受性及其抑菌作用，为转基因乳酪杆菌在生产中的应用提供依据。 利用MRS培养基培养乳酪杆菌并制成感受态细胞，之后通过电击转化将含有植酸酶基因的重组表达载体pIAβ8-phyA转入乳酪杆菌中。通过抗生素筛选、植酸酶活力测定以及SDS-PAGE蛋白电泳检测，证明植酸酶基因已成功地在乳酪杆菌中得到表达。转基因乳酪杆菌分泌到细胞内外的植酸酶活力分别达到4.57和21.31U/ml（P<0.05）。SDS-PAGE蛋白电泳检测，转植酸酶基因乳酪杆菌可表达植酸酶蛋白，其分子量为39.2kDa。 对转基因乳酪杆菌分泌植酸酶进行不同温度和pH处理并测定酶活力变化可知，所分泌的植酸酶最适pH为5.0（P<0.05），最适温度为70℃（P<0.05）。通过对转基因乳酪杆菌培养液的pH、干细胞重、光密度值以及活菌数的测定，可知培养基的pH在乳酪杆菌静止培养72h后达到最低（3.35，P<0.05），干细胞重在培养96h后达到最高（3.9mg/ml，P<0.05），光密度值在培养144h后达到最高（5.89，P<0.05），活菌数在培养48h后达到最大（1.1×109CFU/ml，P<0.05）。综合以上指标以及酶活力随时间的变化规律，可以确定转基因乳酪杆菌的最佳收获时间为厌氧培养96h。 试验选用海藻酸钠、琼脂、聚乙烯醇和明胶对转基因乳酪杆菌进行包埋，之后运用不同的烘干方法进行干燥处理。结果表明，海藻酸钠在添加量为3％条件下包埋和冻干效果最好，活菌数可达7.55×105CFU/g。采用琼脂包埋后则具有较好的耐热性，85℃烘干后活菌数保持在1.68×107CFU/g。 最后，就乳酸菌对抗生素的耐受性及其抑菌作用进行测定。结果表明，当金霉素和硫酸粘杆菌素的添加量分别为大于0.10％和0.05％时，对乳酸菌生长有显著抑制作用（P<0.05）。另外，研究还证实，乳酸菌及其培养液都对致病性大肠杆菌的生长有显著抑制作用（P<0.05）。

目录

文摘

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声明

致谢

引言

第一章文献综述

1.1 植酸及植酸盐

1.1.1 植酸的结构与性质

1.1.2 植酸的抗营养作用

1.1.3 植酸对环境的影响

1.2 植酸酶

1.2.1 植酸酶的种类、来源及性质

1.2.2 植酸酶的功能

1.2.3 植酸酶的作用机理

1.2.4 植酸酶的酶学特性

1.2.5 植酸酶的基因工程

1.3 益生乳酸菌

1.3.1 乳酸菌基因组学

1.3.2 乳酸菌的基因工程

1.3.3 转基因乳酸菌的益生作用

1.4 微生物细胞的固定化

1.4.1 微生物细胞的微囊化

1.4.2 微囊化的概述和回顾

1.4.3 微囊化方法的分类

1.4.4 微囊化细胞的制作方法

1.4.5 微囊化的影响

1.5 乳酸菌的抗生素抗性

第二章植酸酶基因在乳酪杆菌中的高效表达

2.1 材料

2.1.1 仪器设备

2.1.2 菌种和质粒

2.1.3 质粒pIAβ8 图谱

2.1.4 酶与试剂

2.1.5 培养基

2.1.6 溶液配制

2.2 方法和步骤

2.2.1 重组植酸酶基因原核表达载体pIAβ8—phyA的提取

2.2.2 乳酪杆菌感受态细胞的制备

2.2.3 重组植酸酶基因在乳酪杆菌中的表达

2.2.4 转植酸酶基因乳酪杆菌的鉴定

2.2.5 数据处理

2.3 结果与分析

2.3.1 原核表达载体重组质粒pIAβ8—phyA的提取

2.3.2 转植酸酶基因乳酪杆菌的鉴定

2.4 讨论

2.4.1 影响电击转化效率的因素

2.4.2 转基因乳酪杆菌分泌植酸酶的酶活力

2.4.3 转基因乳酪杆菌分泌植酸酶的分子量

第三章转基因乳酪杆菌培养特性及酶学特性分析

3.1 材料

3.1.1 仪器设备

3.1.2 菌种

3.1.3 酶与试剂

3.1.4 培养基

3.1.5 溶液配制

3.2 方法和步骤

3.2.1 转基因乳酪杆菌分泌植酸酶的酶学特性分析

3.2.2 转基因乳酪杆菌的培养特性分析

3.2.3 数据处理

3.3 结果与分析

3.3.3 转基因乳酪杆菌分泌植酸酶的酶学特性分析

3.3.4 转基因乳酪杆菌的培养特性分析

3.4 讨论

3.4.1 不同温度处理对植酸酶活力的影响

3.4.2 不同pH处理对植酸酶活力的影响

3.4.3 转基因乳酪杆菌的收获时间的确定

第四章转植酸酶基因乳酪杆菌的微胶囊化

4.1 材料

4.1.1 仪器设备

4.1.2 菌种

4.1.3 酶与试剂

4.1.4 培养基

4.1.5 溶液配制

4.2 方法和步骤

4.2.1 转基因乳酪杆菌的液体培养

4.2.2 不同包埋材料的包埋

4.2.3 不同方法干燥

4.2.4 活菌数目的测定

4.2.4 数据处理

4.3 结果与分析

4.3.1 海藻酸钠包埋后的效果图

4.3.2 冻干后样品存活率的检测

4.3.3 保存不同时间后样品的光密度值

4.3.4 不同材料包埋晾干后活菌数目的检测

4.3.5 不同温度梯度烘干后活菌数目的检测

4.4 讨论

4.4.1 不同材料包埋对细胞存活率的影响

4.4.2 不同的干燥方法对包埋后细胞存活率的影响

第五章乳酪杆菌对抗生素的耐受性及抑菌作用研究

5.1 材料

5.1.1 仪器设备

5.1.2 菌种

5.1.3 酶与试剂

5.1.4 培养基

5.1.5 溶液配制

5.2 方法和步骤

5.2.1 不同抗生素对乳酪杆菌的抑制作用

5.2.2 乳酪杆菌对致病性大肠杆菌的抑制作用

5.2.3 数据处理

5.3 结果与分析

5.3.1 不同抗生素对乳酪杆菌的抑制作用

5.3.2 乳酪杆菌对致病性大肠杆菌的抑制作用

5.4 讨论

5.4.1 不同抗生素对乳酸菌的抑制作用

5.4.2 乳酸菌及其培养液的抑菌作用

总结

参考文献